DNA提取和制备解读

第一部分DNA提取总论一、提取DNA总的原则：1保证核酸一级结构的完整性；2其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。二、样本来源：理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA样本选择取决于试验目的全血是基因组提取最常见的样本血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上DNA提取前样本采集、预处理和保存：（一）全血1.抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80℃保存2个月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差（二）血浆和血清血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测.三、DNA的收率样本类型基因组DNA收率20mg肝脏组织8g100mg豆苗10g100l全血2g2106培养细胞10g四、DNA提取的基本步骤1、核酸的释放：破裂细胞释放核酸（机械法与非机械法）2、核酸的分离与纯化3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤4、DNA鉴定：浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定五、DNA提取试验中常遇到的问题基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全……DNA降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因加入多糖，保护DNA长度不可忽视的细节—血液基因组提取天根生化科技（北京）有限公司没有严格要求:PCRSouthernBlotsRFLP严格要求片段长度:构建文库PFGE(脉冲场凝胶电泳)DNALengthDNA提取原则1：DNA片段长度•没有严格要求常规PCR•严格要求产物纯度存档、产物长期保存Southern杂交荧光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比较基因组杂交)DNA提取原则2：DNA产物纯度基因组提取方法溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。样本保存和前处理－抗凝血液保存柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。样本保存和前处理－非抗凝血保存非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！样本保存和前处理－白膜层保存全血分离得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。2.冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。3.虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液还是必要的，但用量减半。4.采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。样本保存和前处理－血清/血浆保存现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清/血浆放置-70℃保存。尽量避免样本反复冻融。样本前处理1.冻存的血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3.只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。样本保存和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；干血点：干燥后室温或4℃保存；羊水：-20或-70℃保存。样本前处理1.微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2.干血点加入缓冲液直接进行提取。3.羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。样本保存和前处理－口拭子/漱口水保存口拭子：干燥后室温保存漱口水：4℃保存或离心得到沉淀-20℃或-70℃保存样本前处理1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。2.有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。3.漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。基因组提取流程加入吸附柱缓冲液漂洗DNA洗脱收集样本裂解纯化去蛋白沉淀核酸洗涤去盐溶解DNA沉淀样本裂解溶液法（盐析法）吸附柱法红细胞裂解哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加入进行裂解).采用细胞裂解液进行裂解（TIANGEN的细胞裂解液CL是按照2.5倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因组DNA的提取。红细胞裂解充分的现象：得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。核细胞裂解如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：TIANGEN试剂盒中的GB或FG）和蛋白酶K需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进行水浴。水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴时间10-30min.若采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相。核酸吸附或沉淀硅胶膜吸附法1.加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。2.将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐低pH值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅胶膜上。溶液法1.当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。2.加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因过于猛烈的外力而降解。3.分离沉淀的方法：a.用枪头小心地将丝状沉淀挑出；b.离心分离，应保证一定的转速和时间。核酸洗脱或溶解硅胶膜吸附法1.用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液TBbuffer（或自己配制的buffer）后放置5-10min后再进行离心得到基因组DNA。溶液法1.使用70-75％乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解DNA前需要室温或37℃放置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的TBbuffer（或自己配制的buffer）溶解DNA。浓度：100－300ng/ul纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保存到-20℃，反复冻溶会导致DNA的降解。溶解DNABuffer：纯化得到的基因组DNA最好溶解在TBBuffer(TIANGEN)或者Tris缓冲液里，因为大片段的基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。核酸保存纯度（OD260-320/OD280-320）紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释4－5倍；溶液裂解法稀释20－30倍）OD260-320/OD280-3201.7说明有蛋白的污染OD260-320/OD280-320＝1.7～1.9说明纯度很好OD260-320/OD280-3201.9说明有部分降解或有RNA污染得率紫外分光光度计进行测量Yield＝OD260×50ng/ul×稀释倍数DNA检测方法－紫外分光光度法Tiangen产品提取得率产品详细细节请直接点击产品名称样本处理量DNA/RNA得率（μg）推荐试剂盒哺乳动物全血100μl2DP327-磁珠法基因组提取试剂盒DP316-微量样品基因组DNA提取试剂盒200μl4-12DP318-血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)600μl12-201ml4-30DP319-血液基因组提取试剂盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽类、两栖类全血5-205-40DP318-血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)血凝块200-500ul1-8DP318/DP319500-1000ul8-15DP318/DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子1个0.5-3.5DP322-口腔拭子基因组提取试剂盒DNA检测方法－电泳检测取2μl洗脱液1%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA分子大小，纯度以及完整性TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒提取相同血样不同起始体积的DNA电泳图电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本来源一致，分别取1μl，10μl，50μl，100μl为起始样本提取基因组。各取2μl基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析实验结果。DNA检测方法－荧光定量PCR检测微量样本基因组DNA的检测通常采用荧光定量PCR检测，例如：干血点、微量血液等。试剂选择指南硅胶膜吸附法微量样本（DP316）口拭子（DP322）0.2-1ml血液(DP318)应用：1.HLA分型、亲子鉴定及芯片检测实验：对DNA的纯度、浓度均有要求。2.口拭子等特殊样本的提取适合样本：全血、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞、口拭子、干血点、羊水、血清/血浆、漱口水、微量组织等溶液法(DP319)应用：下游实验所需DNA量较大，例如SNP适合样本：全血、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞等磁珠法(DP327)应用：微量样本DNA提取，可配合工作站使用。适合样本：微量血液、干血点、微量组织