叶绿体-(-类囊体-)的-Hill反应活力测定

一、叶绿体一、叶绿体((类囊体类囊体))的的HillHill反应活力测定反应活力测定™叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，依据分离所得叶绿体的结构完整程度，大致将它分成两类：™被膜破碎的叶绿体（类囊体）具有光合电子传递、光合放氧和光合磷酸化的功能™被膜完整的叶绿体具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。™下面介绍类囊体的制备及其Hill反应活力测定。•（一）实验原理•用STN（Sucrose,Tricine或Tris,NaCI）提取并经分级离心的叶绿体碎片，具有完整的类囊体，把其放入一定的反应介质中给予照光，能通过反应中心的电子传递进行希尔反应、放氧和光合磷酸化。当用Fecy(Fe3+)作为电子受体时，它接受电子还原为Fe2+，而Fe2+可与邻菲啰啉（OP）反应生成红色的络合物，510nm下的OD与Fe2+的浓度成正比，由此可测定希尔反应活力。FecyFe3++ADP+32PiFe2++AT32P+H2O•（四）实验步骤•1.配制STN研磨液•取Tricine（或Tris,0.2mol/L,pH值7.4）10ml、Sucrose（1mol/L）40ml、NaCl（0.1mol/L）10ml，定容到100ml。•2.希尔反应活动测定•（1）将STN、研具、烧杯、离心管、纱布放入冰箱冰冻(约15分钟)。•（2）样品洗净后放入冰箱(4℃~8℃)15-20min。•（3）配制反应液。使其昀终浓度为：Tricine（或Tris,pH值8.0）50mmol/L、MgCl22mmol/L、Fecy1mmol/L、Na2HPO42mmol/L、ADP1mmol/L。配好反应液后分装入指管，每只2ml。•（4）水浴调温。把玻璃缸的水温调至合适范围（菠菜、小麦、蚕豆20℃，水稻25℃），其内放入指管。•（5）叶绿体（类囊体）的提取。•叶片去中脉剪碎•加STN（约5-10ml/g）•迅速研磨成颗粒状•四层纱布过滤，•离心•4000r/min离心1min~2min，•沉淀悬浮（1~2mlSTN）•离心1000r/min1min,•上层液于另一只试管，用STN稀释到约含叶绿素200µg/ml，放入冰浴用于测定Hill反应活力和叶绿素含量。•（6）照光反应。•调准缸内水温，每管加叶绿体提取物0.2ml，开灯照光1min，闭灯后立即加20%TCA0.2ml以中止反应。以照光前加0.2ml20%TCA的对应试管作对照。•（7）Fe2+的测定。•将上述试管以4000r/min离心2min，取二支试管，放入试管（用遮光试管架）中，分别取离心后的上清液0.7ml，加Na3C6H5O7溶液（0.2mol/L）2ml、水1ml、FeCl3（0.01mol/L）0.1ml、OP（0.05mol/L）0.2ml，摇匀，置约25℃下显色15min,在510nm下分别测定照光和对照的OD值，以用水代替上清液的为对照。•（8）叶绿素含量测定。•取上述叶绿体提取物0.2ml加4.8ml80%丙酮，摇匀，以4000r/min离心1min~2min，在652下测OD值。•按下列方程计算叶绿素含量：Chl(μg/ml)=×25OD652×100034.5•（五）结果计算：希尔反应活力=×××60(Fe2+形成µmol.mg-1Chl.h-1)OD(光照—对照)2.45000ODμmol-1Fecy0.7Chl(μg/ml)