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浅谈RP-HPLC方法的建立蒋辉防化研究院生物有机实验室浅谈RP-HPLC方法的建立1总论2卓有成效的工作方法3样品的性质和预处理4分离的基础5系统方法的建立6保证柱寿命和性能的步骤高效液相色谱法总论•绝大多数实验室中，HPLC方法的建立仍在靠经验进行•首先进行反相色谱实验，调整流动相中有机相的比例，以求得足够的分离度、合理的操作时间以及易于检测的谱带。•改用不同的色谱柱，改变温度和流动相pH值，优化筛选溶剂的配比组成，以其它溶剂代替原来有机溶剂。或者试用别的HPLC方法卓有成效的工作方法•1首先估价样品与分离目的（切不可低估此步的重要性）•2设计开始的分离条件，使之有可能在一两次实验中，便可能得到有希望的色谱图。•3预测可能发生的问题，当问题出现时，能用已知的办法解决。卓有成效的工作方法•4有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。•5应对每次实验进行设计，能提供有用信息。•6HPLC的目的是分离，而不必使所需谱峰“过渡分离”。样品的性质和预处理–可直接进样的样品溶液–需稀释缓冲pH或添加另一液体的溶液–能在流动相中溶解的固体–含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前将其去除的溶液–含有不容性赋性剂的混合物（动植物组织，高交联度聚合物、干性黏合剂）–绝大多数样品需经称重或稀释后进样，一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。分离的基础：流动相的作用•要分离好的好，有两条途径：一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。•Rs=(t2-t1)/[(1/2(w1+w2)]•t1，t2为二相邻谱带间的保留时间，w1和w2为它们基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs≥1.5时为完全分离。•当峰发生重叠时，难以准确测量到基线处的峰宽，更的办法好是用半高处的相应峰宽1和2：•Rs=1.18(t2-t1)/(1+2)•Rs≥1.25在一般情况下，能达到≥99％的分离度。•新柱的起始色谱图的Rs值越大，意味着该柱用此法时间越长。•Rs≤1.0时定量分析一般精密度较差。分离度与溶剂强度的关系•Rs=(1/4)(-1)N0.5[k’/(1+k’)]•k’代表了溶剂强度；为分离因子；N为理论塔板数。•溶剂强度的增大，Rs增大，满意的范围1k’20•在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。柱类型与温度选择性的关系•柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。•温度的选择性，温度的变化会影响分离度，因为理解的程度与温度有关。色谱柱与塔板数的关系•一般塔板数越大，分离度越好•合格的HPLC的塔板数，一般不应低于标准值的80％，否则为不合格。色谱柱条件•流速适中，过高会降低塔板数。•当流动相粘度增加时，塔板数会降低，•对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在50度时较好。其他因素•工作压力：低于150bar•操作时间：应尽可能短•峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰•溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好色谱柱问题与解决办法•保留值与分离度的重现性–1选柱时，应考虑其化学性质–2在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应，尽量减少谱峰拖尾。–3保证温度、流速、和压力、溶剂成分恒定–4脱气–5保证上样不超载1～10ug/mg填料。–6使用同一批生产批号的材料谱峰拖尾•柱坏•污物在柱进口处堆积•样品超载•样品溶剂不合适•化学或次级保留效应•缓冲不足•重金属污染柱外效应•进样阀体积过大•进样阀、色谱柱及检测器之间的管线过长或直径过粗•检测器流动池体积过大系统方法的建立•1检测条件的选择•2梯度洗脱进行首次实验•3优化流动相的选择性•提高分离度有三种方法：–1提高塔板数–2改变有机相比例，以改变谱峰间距–3更换流动相溶剂，以改变谱峰间距梯度洗脱优点–一次初始的梯度操作通常足以判断出大约正确的溶剂强度的流动相，使样品充分分离，通过分析谱峰，简化分确定离条件的步骤–建议用乙腈/水作流动相进行首次分离–乙腈操作压力低，溶剂强度高，检测波长宽：可在185－205nm检测–其他有机溶剂：甲醇，丙醇，异丙醇，四氢呋喃反相HPLC中的溶剂优化•MeOH,ACN,THF似乎可以满足反相HPLC要求：•容易样品：ACN/水•一般样品：MeOH/水•THF/水困难样品：多员梯度MeOHH2OACNTHF优化反相HPLC步骤•1选择标准梯度条件进行首次实验–乙腈/水5－100％25min,2ml/min或–乙腈/水5－100％50min,1ml/min•2调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始和结束时的时间浪费•3如果色谱峰复杂，分离较差：–延长梯度时间–加长柱长–使用细粒度的柱–降低流速以提高塔板数•4一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流速以调整峰间距•5需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶剂重现性好的分离•色谱平衡•通常情况下，柱子用15～20柱体积的起始流动相充分冲洗后方可达到柱平衡。柱再生所需时间通常约等于梯度时间。•基线问题•等梯度HPLC等梯度反相分离等梯度反相分离1100％ACN流动相降低％ACN，直至所有谱峰分离分离不充分微调％ACN，控制分离度分离不充分改为等强度MeOH改为等强度MeOH分离不充分可见谱峰间距变化改为50/50ACN/MeOHACN/MeOH混合液分离不充分可见谱峰间距变化改为等强度THF50/50MeOH/THF混合液分离不充分改为50/50ACN/THF分离不充分1:1:1ACN/THF/MeOH分离不充分改换另一种LC方法保证柱寿命和性能的步骤–1选择好填充柱–2减小压力波动，避免冲撞击–3用保护柱和在线过滤片–4经常用强溶剂冲洗柱子：反相用1:1的异丙醇/氯仿，正相用甲醇–5样品预处理，尽量减少无谓的强滞留成分和微粒–6用较柔和的pH值3－7；防止键和相的流失–7储存时冲洗掉盐缓冲液，以纯乙腈保存柱，避免高浓度的水和醇类