仙鹤草中鹤草酚的提取及分离纯化研究

仙鹤草中鹤草酚的提取及分离纯化研究姜晓姝1，金宏波1，白淑芝2，刘晓滨3(哈尔滨医科大学1．机能学实验教学中心;2．病理生理学教研室，黑龙江哈尔滨150081;3．哈尔滨医科大学附属第二医院肿瘤放疗科，黑龙江哈尔滨150086)摘要:目的从中药仙鹤草中提取鹤草酚，并对其初步分离纯化进行研究。方法采用超声波法对仙鹤草活性成分鹤草酚进行粗提，并依次用两相溶剂萃取法与酸碱分离法进行纯化。采用薄层层析法和紫外分光光度法对其纯度进行定性分析;用高效液相色谱对其进行含量测定。结果分离纯化的鹤草酚纯度达到65．09%。结论研究出了一条以仙鹤草为原料，经超声波提取，再经乙酸乙酯、碳酸钠、及氢氧化钠酸碱分离，纯化鹤草酚的新工艺路线。关键词:鹤草酚;薄层层析法;紫外分光光度法;高效液相色谱法doi:10．3969/j．issn．1009－6469．2015．04．008SeparationandpurificationofagrimopholfromHairyveinAgrimoniaHerbJIANGXiao-shu，JINHong-bo，BAIShu-zhi，etal(HarbinMedicalUniversity，Harbin150081，China)Abstract:ObjectiveToextract，separateandpurifyagrimopholfromChinesemedicineHairyveinAgrimoniaHerb．MethodsInthepresentstudy，anewmethodofmicrowave-assistedextraction(MAE)wasusedtoextractagrimopholfromHairyveinAgrimoniaHerb．Andthenwepurifiedagrimopholbybiphasesolventextractionseparationandacid-baseisolation．Inordertoinvestigatethepurityofagrimophol，qualitativeanalysiswasperformedbythinlayerchromatographyandultravioletspectrophotometry．Quantitativeanalysiswasperformedbymeansofhighperformanceliquidchromatography(HPLC)．ResultsThepurityofagrimopholwasabout65．09%afterpurification．ConclusionAnewprocessforpurificationofagrimopholhasbeendevelopedbymicrowave-assistedextractionandaceticacidethylester，sodiumcarbonate，sodiumhydroxideisolationfromHairyveinAgrimoniaHerb．Keywords:agrimophol;thinlayerchromatography;ultravioletspectrophotometry;HPLC基金项目:黑龙江省留学归国人员基金项目(NoLC08C11)通信作者:刘晓滨，男，副教授，研究方向:肿瘤放射治疗，E-mail:[e-mail]仙鹤草(AgrimoniaPilosaLedeb)，为蔷薇科多年生草本植物龙牙草的全草，又名脱力草、龙牙草、狼牙草、黄龙草等，在中国大部分地区均有分布。仙鹤草中含有挥发油、微量元素、仙鹤草素、仙鹤草内脂、鞣质、甾醇、有机酸、酚类化合物和糖苷类等化合物［1］。现代药理研究表明，鹤草酚具有抗肿瘤极其显著的放射增敏作用［2－4］。近年来，国内学者尝试用不同的方法对鹤草酚的提取、含量测定等进行了一些研究。本实验在总结前人各种提取、测定方法［5－9］优点的基础上，创新运用超声波法对仙鹤草中鹤草酚进行粗提，并结合两相溶剂萃取法和酸碱分离法，对鹤草酚分离纯化进行研究，具有快速、简便、回收率高的特点，希望本研究所建立的测定方法能为仙鹤草酚的定量研究以及开发利用提供帮助。1材料与方法1．1实验材料仙鹤草购于哈尔滨世一堂大药房;鹤草酚对照品(纯度:68．71%，黑龙江省卫生学校植化室自制，经哈尔滨医科大学分析中心、哈尔滨医科大学和黑龙江省药检所联合测定);无水乙醇、石油醚、氯仿等试剂均为国产分析纯。1．2实验仪器紫外可见分光光度计(UV－2100、上海尤尼柯、上海优浦科学仪器有限公司);高效液相色谱仪(LC－20A、岛津、日本);薄层层析硅胶板(G型、50mm×100mm、青岛裕民源硅胶试剂厂)。1．3实验方法1．3．1鹤草酚的提取、分离纯化精确称取仙鹤草经粉碎至20目的样品，在一定乙醇质量分数、物料配比、时间、温度下进行超声提取。一次超声提取的滤液经二次超声提取，二次的滤液进行三次提取，三次提取的滤液用于重新加料时的一次提取的提取液。一次、二次滤液为超声提取的提取物，合·346·安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2015Apr;19(4)ChaoXing并后浓缩至一定体积，加无水乙醇定容至100mL，进行分析测定。将仙鹤草提取物1g，溶于20mL乙酸乙酯中，转入分液漏斗，加入10mL5%Na2CO3反复振摇、静置，分出下层液Na2CO3相，如此萃取2次;然后向分液漏斗中乙酸乙酯相加入10mL5%NaOH反复振摇、静置，分出下层液NaOH;加入10%HCl至pH2时，析出淡黄色絮状物;过滤，弃去溶液，沉淀用双蒸水洗至中性，减压干燥得鹤草酚粗晶;用5mL氯仿溶解，过滤，将滤液室温放置，挥发出三分之一体积的氯仿后加入石油醚5mL，室温放置，逐渐析出结晶，滤取结晶(黄绿色斜方棱晶)得纯化物，用HPLC法经面积归一化计算鹤草酚的含量。1．3．2纯化物的检测分析薄层层析鉴定:取经纯化获得的纯化物和对照品各5mg，分别置于小试管中，各加氯仿5mL溶解。用微量注射器各吸取5μL，点于5cm×10cm的G硅胶板的点样线上，竖直放入盛有展开溶剂的密闭展析缸中，待溶剂上行约7．7cm处时取出，迅速用铅笔画出溶剂的前沿线，待溶剂挥发干后，喷浓硫酸加热显色，在显示颜色的斑点位置，用铅笔轻轻标记，测量并计算物质所移动的距离与溶剂前沿所移动的距离的比值(即Rf值)。紫外分光光度法鉴定:仪器工作条件为狭缝宽度5．0，测定波长间隔0．2nm，扫描速度为快速。取获得的纯化物(精品鹤草酚)5mg，加无水乙醇溶解，并定容至50mL，再稀释到含量为4mg·L－1，pH7．5～8．0的溶液;同时配制对照品含量为4mg·L－1溶液，用紫外可见分光光度计在波长200～400nm之间扫描，观察其吸收图谱。纯化物中鹤草酚含量的测定:采用HPLC法，经面积归一化法计算鹤草酚的含量。色谱柱:岛津C18柱(250mm×4．6mm，5μm);流动相:甲醇—水—三乙胺(58∶42∶0．2);流速:1．2mL·min－1;检测波长:325nm;柱温:30℃。对照品溶液制备:称取鹤草酚对照品10mg，用少量氯仿溶解后，置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。吸取该溶液4mL，置于10mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，制成浓度为0．04g·L－1的鹤草酚对照品溶液。微孔滤膜(0．45μm)滤过取续滤液即可作为对照品溶液。样品溶液的制备:称取鹤草酚纯化物10mg，用少量氯仿溶解后，置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。吸取该溶液4mL，置于10mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，制成浓度为0．04g·mL－1的鹤草酚样品溶液。微孔滤膜(0．45μm)滤过取续滤液即可作为对照品溶液。样品面积百分含量的计算:试样中鹤草酚的峰面积百分含量Xi(%)按下式计算:Xi=(Ai/∑Ai)×100%Xi为试样中鹤草酚的质量分数;Ai为试样中组分I的峰面积。2结果2．1超声波提取的工艺条件超声波提取工艺条件试验设计为四因素三水平正交试验，各因素水平设计见表1，正交表头L9(34)及结果见表2。对试验结果分析如下:(1)通过对极差的表观分析得到:最优工艺条件为:溶剂60%乙醇，液料比10∶1，超声时间30min，超声温度70℃，提取收率为0．183%。(2)因本试验设计为饱和正交试验，为提高分析的灵敏度，特将液料比B的残差平方和(其在各因素中最小)视作误差项，据此对试验结果资料进行方差分析。结果:乙醇质量分数因素P值最小(P≈0．05，接近显著)，提示该因素可能是最重要的影响因素，其次分别为超声时间，超声温度。表1正交因素表水平乙醇质量分数A/%液料比B/mL·g－1超声时间C/min超声温度D/℃15010∶1206026015∶1307037020∶14080表2正交试验结果试验号乙醇质量分数A/%液料比B/mL·g－1超声时间C/min超声温度D/℃提取率/mg·kg－1111111．10212221．53313331．27421231．83522311．55623121．68731321．76832131．37933211．48K13．904．614．154．13K25．064．454．844．97K34．614．434．584．47K11．301．541．381．38K21．691．481．611．66K31．541．481．531．49极差0．390．060．230．28优水平A2B1C2D2最佳组合A2B1C2D2·446·安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2015Apr;19(4)ChaoXing表3正交试验结果的方差分析方差来源平方和自由度均方FP乙醇质量分数A/%0．22820．11416．3390．058液料比B/mL·g－10．01420．0071．0000．500超声时间C/min0．08120．0405．8010．147超声温度D/℃0．11920．0608．5290．105误差0．0000合并误差0．01420．007总和0．44282．2鹤草酚的纯化用60%乙醇超声提取获得的鹤草酚粗品，尚混杂有鞣质、有机酸、黄酮等杂质化合物。经乙酸乙脂溶解滤去不溶物后，再经质量分数为5%碳酸钠、5%氢氧化钠溶液进行溶液萃取，分出黄酮类及有机酸类物质，得到鹤草酚富集液。鹤草酚富集液经盐酸沉淀处理、氯仿重结晶，得到高纯度的鹤草酚结晶。2．3纯化物的检测2．3．1纯化物的薄层层析从图1可以看出，纯化物(样品)和对照品(鹤草酚)均只有一个移动斑点。展开溶剂环已烷∶无水乙醇∶乙酸乙酯∶冰醋酸(25∶1∶5∶3)时溶剂的前沿线所移动的距离为7．7cm，对照品所移动的距离为6．6cm，纯化物所移动的距离为6．6cm，对照品Rf标=0．85，样品Rf试=0．85。经纯化获得的样品和对照品鹤草酚的分子量相同，可初步证实本品为鹤草酚。图1纯化物的薄层层析结果2．3．2纯化物的紫外分光光度法分析纯化物(鹤草酚)和对照品(鹤草酚)在波长200～400nm之间进行扫描，在338nm和346nm显现两个高峰，274nm处显现一个高峰与对照品最大吸收的光谱图相同(图2)，说明经纯化获得的鹤草酚纯品和对照品鹤草酚具有相同的组分。对照品实验纯化物图2纯化物紫外吸收光谱图2．3．3纯化物中鹤草酚的含量经HPLC法面积归一化计算鹤草酚的含量为65．09%(图3)对照品实验纯化物图3纯化物HPLC色谱图3讨论天然多酚类物质在植物中广泛存在，不仅种类和数量繁多，而且存在的形式既复杂又多种多样［10－12］。所以针对不同的天然物质中的多酚，测定方法可以有多方面选择，本实验以采用超声波法提取的仙鹤草提取物为样品，研究鹤草酚的分离纯化方法。结果表明，采用两相溶剂萃取法与酸碱分离法相结合，然后用氯仿重结晶法，使鹤草酚的纯度达到65．09%。实验结果证明，选择合适溶剂是结晶重结晶过程的关键。而溶剂的用量、降