药理学毒理学试验食品评价

1毒理学实验食品安全性评价广州蓝韵医药研究有限公司专注于中药新药临床前研究、保健食品研究、项目注册【目的要求】掌握食品安全性评价的相关概念掌握食品安全性毒理学评价的阶段和试验内容掌握食品风险性评价3第一节毒理学基本概念毒物(toxicant，poison）在一定条件下，较小剂量即对机体造成损害作用或使机体出现异常反应的外源化学物Paracelsus经典之言：所有物质都是毒物，没有物质不是毒物，唯一的区别是它们的剂量4毒性(toxicity)：指外源化学物与机体接触或进入机体后，对机体引起损害作用的相对能力。毒性大小与机体接触毒物的条件有关，如接触剂量、途径和频度等。5外源化合物（xenobiotic）：存在与人类生活的外界环境中，可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定的生物学作用的化学物质，又称“外源生物活性物质”，包括人工合成和自然界存在的外源物。内源化合物：是指机体内原已存在的和代谢中所形成的产物或中间产物。6剂量（dose）给予机体的数量或与机体接触的数量常以mg/kg体重、mg/m3空气、mg/L水为其剂量单位7绝对致死量（absolutelethaldose,LD100）：指外源化学物引起一群受试动物全部死亡的最低剂量最小致死量（minimallethaldose，MLD，LD01，LDmin）：指外源化学物使受试动物群体中仅引起个别发生死亡的剂量半数致死量（medianlethaldose，LD50）：又称致死中量，指外源化学物能引起一群动物50%死亡的剂量或浓度8效应（effect）：指一定剂量外源化学物与机体接触后所引起的生物学改变反应（reponse）：指一定剂量外源化学物与机体接触后，呈现某种效应并达到一定程度的比率，或者产生效应的个体数在某一群体中所占的比率。9量反应（gradedreponse）有强度和性质的差别变化的程度可用计量单位表示，效应的观察结果为计量资料，如血清谷丙转氨酶改变多少单位质反应（quantalreponse）没有强度的差别效应的观察结果为计数资料，不能用具体的定量数值表示只能用“阴性或阳性”、“有或无”来表示，如死亡或存活10剂量-反应关系毒理学的重要概念，如果要确定机体的某种损害作用是由某种外源化学物所引起，除过敏反应外，一般应存在剂量-反应关系11剂量-反应曲线剂量-反应关系可以用曲线表示，以剂量为横坐标，以表示量反应强度的计量单位或表示质反应的百分比为纵坐标，建立曲线基本类型：直线S形曲线抛物线12直线型化学物剂量的变化与效应强度或反应率的改变呈正比见于某些体外试验中的一定剂量范围内，在生物体内较少见13抛物线型曲线先陡峭后平缓，最初随剂量增加，曲线增高急速，随后变得缓慢，呈抛物线型。如将剂量换为对数值，则抛物线型曲线呈一直线常见于剂量-反应曲线14Ｓ形曲线型曲线先平缓、后陡峭，最后趋于平缓，呈“Ｓ”状，表明在低剂量范围内，随着剂量增加，反应或效应强度增高较为缓慢，剂量较高时，反应或效应强度也随之急速增加，剂量继续增加时，反应或效应强度增高又趋于缓慢多见于剂量-反应关系中15最大无作用剂量（maximalno-effectlevel，MNEL）指某种外源化学物在一定时间内按一定方式或途径与机体接触后，根据目前的认识水平，用最灵敏的试验方法和观察指标，未能观察对机体造成任何损害作用或使机体出现异常反应的最高剂量最大无作用剂量又称为未观察到作用的剂量(no-observedeffectlevel，NOEL)或未观察到损害作用的剂量（no-ob-servedadverseeffectlevel，NOAEL）16最小有作用剂量（minimaleffectlevel,MEL）又称中毒阈值(toxicthresholdvalue)或中毒阈剂量(toxicthresholdlevel)，指在一定时间内，一种外源化学物按一定方式或途径与机体接触，并使某项灵敏的观擦指标开始出现异常变化或机体开始出现损害作用的最低剂量严格地讲，最小有作用剂量不应该叫做“有作用”剂量，而应该是“观察到作用”的剂量。因此，最小有作用剂量的确切概念为观察到最低作用剂量（lowestobservedeffectlevel，LOEL）或观察到最低有害作用剂量（lowestobservedadverseeffectlevel，LOAEL）17通过亚慢性毒性试验和慢性毒性试验结果，可以确定最大无作用剂量和最小有作用剂量。最大无作用剂量是评定外源化学物对机体造成损害作用的主要依据，也是制订某种外源化学物每日容许摄入量(acceptabledailintake,ADI)、最高容许浓度(maximalallowableconcentration,MAC)、最高残留限量(maximalresiduelevel,MRL)的基础18每日容许摄入量(acceptabledailyintake,ADI)：指人类终生每日随同食物、饮水和空气摄入的某一外源化学物，对健康不致引起任何可观察到损害作用的剂量19第二节食品安全毒理学评价安全性毒理学评价（toxicologicalsafetyevaluation)：通过动物实验和对人群的观察，阐明待评物质的毒性及潜在的危害，决定其能否进入市场或阐明安全使用的条件，以达到最大限度的减小其危害作用、保护人民身体健康的目的20食品安全性毒理学评价程序一、参照标准：《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193.1~15193.19-1994二、分四阶段试验：第一阶段：急性毒性试验第二阶段：遗传毒性试验、短期喂养试验和致畸试验第三阶段：亚慢性毒性试验和代谢试验第四阶段：慢性毒性包括致癌试验21第一阶段急性毒性阶段目的：了解受试物毒性强度、性质和可能的靶器官，为选择进一步毒性试验的剂量和毒性判定指标提供依据项目：测定经口LD50结果判定：当LD50＜10倍人的可能摄入量时：应放弃当LD50＞10倍人的可能摄入量时：进入下一阶段毒理学试验当LD50为人的可能摄入量10倍左右时：应进行重复试验，或用另一方法验证22急性毒性：指人或动物一次或24h之内多次接触外源化学物后，在短期内所发生的毒性效应，包括致死效应试验设计要点动物选择剂量分组染毒途径试验期限观察指标23我国食品毒理学中外源化学物经口毒性分级标准24第二阶段遗传毒性试验目的：对受试物遗传毒性和是否具有潜在的致癌性进行筛选项目：Ames试验为首选小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变分析小鼠精子畸形试验睾丸染色体畸变分析或显性致死试验25结果判定3项为阳性：可能具有遗传毒性和致癌性，应放弃2项为阳性：且短期喂养试验有显著毒性作用，应放弃；如短期喂养试验有可疑毒性作用，则根据重要性和可能摄入量权衡利弊1项为阳性：从备选遗传毒性试验中选择2项试验所选2项均为阳性，应放弃1项为阳性，短期喂养试验和传统致畸试验未见明显毒性和致畸性时，进入第三阶段4项均为阴性：进入第三阶段26主要致突变试验Ames试验微核试药哺乳动物细胞基因突变试验显性致死试验染色体畸变试验姐妹染色单体交换试验程序外DNA合成试验果蝇伴性隐性致死试验单细胞凝胶电泳试验小鼠淋巴瘤试验271.Ames试验——细菌回复突变试验菌株：鼠伤寒沙门氏菌运用最广的菌株，标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感组氨酸缺陷突变菌(his-)：不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长回复突变野生型菌株(his+)：能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落目的：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力28Ames试验原理：组氨酸缺陷型菌(his-)野生型菌株(his+)正向突变回复突变诱导作用某化学物29结果评定阳性诱发回变菌落数/自发回变菌落数≥2有剂量-反应关系或至少某一测试点有重复并有统计学意义结果应是至少两次独立试验的重复结果只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物；仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物302.微核试验微核：染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核常用啮齿类动物骨髓多染红细胞(PCE)微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时有的红细胞的主核已排出，微核容易辩认观察的遗传学终点：染色体完整性改变和染色体分离改变3132微核照片结果：1、微核率：计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数2、观察嗜多染红细胞与正染红细胞(PCE/NCE)比值，一般计数200个红细胞33第二阶段传统致畸和30d喂养试验目的：了解受试物对胎仔是否具有致畸作用和初步估计NOEL结果判定：未发现明显毒性作用，综合其他试验作出初步评价有明显毒性作用，且有剂量-反应关系，应作进一步的毒性试验34第三阶段亚慢性毒性试验目的：观察较长时间以不同剂量水平喂养后的毒性作用性质和靶器官；初步确定NOEL；为慢性毒性和致癌试验的剂量选择提供依据；了解受试物对动物繁殖及对子代的致畸作用项目：90d喂养试验和繁殖试验结果判定：NOEL≤100倍人的可能摄入量：表示毒性较强，应放弃100倍＜NOEL＜300倍：进行慢性毒性试NOEL≥300倍：进行安全性评价35第三阶段代谢试验目的：了解受试物在体内的吸收、分布和排泄的速度及蓄积性了解有无毒性代谢产物形成寻找可能的靶器官为选择慢性毒性试验的动物种系提供依据36第四阶段慢性毒性试验（包括致癌试验）目的：了解长期接触受试物后的毒性作用，尤其是进行性或不可逆的毒性作用了解是否有致癌作用确定NOEL，为最终评价受试物能否用于食品提供依据结果判定：NOEL≤50倍人的可能摄入量：表明毒性较强，应放弃50倍＜NOEL＜100倍：经安全性评价后再作决定NOEL≥100倍：可考虑用于食品37致癌试验一、短期试验（筛选作用）1、致突变试验Ames试验姐妹染色体交换试验小鼠淋巴瘤试验2、细胞转化试验观察细胞形态、细胞生长能力、生化表型等变化，以及移植于动物体内能形成肿瘤的能力383、哺乳动物短期致癌试验小鼠肺肿瘤诱发试验大鼠肝转变灶诱发试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验二、哺乳动物长期致癌试验39ADI=NOEL/SF根据ADI，制定食品允许限量40第三节食品安全性风险分析风险（Risk）：由于食品中的某种危害而导致的有害于人群健康的可能性和副作用的严重性风险就是度量一个不利事件发生的可能性、发生的几率、不利结果、结果的严重性41风险分析框架风险评估风险管理风险交流基于科学基于政策关于风险的信息和意见的互动交流42风险分析（RiskAnalysis）有三部分组成风险评估（RiskAssessment）：核心和基础风险管理（RiskManagement）风险信息交流（RiskCommunication）431、风险评估(1)危害识别（危害确定）(2)危害特征描述(3)暴露评估（摄入量评估）(4)风险特征描述44（1）危害确定（HazardIdentification）：对可能在食品或食品系列中存在的，能够对健康产生副作用的生物、化学和物理的致病因子进行鉴定。（2）危害特征描述（HazardCharacterization）：定量、定性地评价由危害产生的对健康副作用的性质。对于化学性致病因子要进行剂量－反应评估；对于生物或物理因子在可以获得资料的情况下也应进行剂量－反应评估。45（3）暴露评估（ExposureAssessment）：定量、定性地评价由食品以及其它相关方式对生物的、化学的和物理的致病因子的可能摄入量。（4）风险特征描述（RiskChar