实验：琼脂糖明胶电泳

琼脂糖明胶电泳技术六、思考题四、注意事项与实验技巧五、跑出好看的电泳图三、实验方法一、实验原理二、仪器、材料与试剂琼脂糖明胶电泳技术一、实验原理1.电泳带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。电荷密度、电压及电流成正比，与分子大小、介质黏度及电阻成反比。一、实验原理电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。一、实验原理2.分类DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳分类分离长度琼脂糖凝胶电泳200bp—近50kb聚丙烯酰胺凝胶电泳5—500bp分辨率高一、实验原理⑴琼脂糖明胶电泳琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应质粒DNA分子有三种构型:CCDNA(共价闭合环状DNA:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋)、OCDNA(开环DNA：质粒的一条链断裂)LDNA(线形DNA：质粒的两条链均断裂)，\这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CCDNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNACCDNALDNAOCDNA电泳方向含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）]DNA/RNA分子的分离范围（kb）0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—320.1—2⑵聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成可以分离小片段（5～500bp）DNA分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：•蛋白质分子的分离鉴定，蛋白质分子量的测定，核酸的分析，核酸序列测定一、实验原理一、实验原理3.琼脂糖凝胶电泳实验原理⑴在pH值为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。⑵采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。⑶核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。微波炉琼脂糖凝胶电泳系统紫外线透射仪质粒DNADNAmarker50×TAE6×凝胶加样缓冲液琼脂糖1％溴化乙锭溶液溶解琼脂糖分离质粒DNA片段检测质粒DNA片段电泳样品DNA相对分子质量标准物电泳缓冲液沉降DNA并起指示作用电泳支持介质嵌入DNA中，在紫外灯下显色二、仪器、材料与试剂二、仪器、材料与试剂1.琼脂糖凝胶电泳系统二、仪器、材料与试剂2.紫外投射仪二、仪器、材料与试剂3.DNA的染料EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng的DNA注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套二、仪器、材料与试剂•GoldView™:是一种可代替EB的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView™与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。二、仪器、材料与试剂4.电泳缓冲液的组成⑴Tris—乙酸（TAE）⑵Tris—硼酸（TBE）⑶Tris—磷酸（TPE）其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8,这些缓冲液均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。常用的电泳缓冲液的配制缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris—乙酸（TAE）1×：0.04moL/LTris—乙酸0.001moL/LEDTA50×：242gTris碱57.7mL冰乙酸100mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—磷酸（TPE）1×：0.09moL/LTris—磷酸0.002moL/LEDTA10×：108gTris碱15.5mL85%磷酸40mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—硼酸（TBE）0.5×0.045moL/LTris—硼酸0.001moL/LEDTA5×：54gTris碱27.5g硼酸20mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)5.加样缓冲液类型6×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液4℃II0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖水溶液室温III0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液4℃IV0.25%溴酚蓝40%（W/V蔗糖水溶液）4℃V（碱性加样缓冲液）300mmoL/LNaOH6mmoL/LEDTA18%聚蔗糖水溶液0．15%溴甲酚绿0．25%二甲苯青FF4℃加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。二、仪器、材料与试剂6.Marker的选择DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。三、实验方法1．50×TAE的稀释：如制备50mL1×TAE，取1mL50×TAE加入49mL水定容至50mL。2．制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mLTAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至60℃。(加入浓度为10mg/mL的EB2μL，使EB的终浓度为1μg/mL)。三、实验方法3．用胶带封住胶床，放好梳子。三、实验方法4.将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固20—60min。三、实验方法5.在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。6.向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。7.分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。三、实验方法8.正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为50mA。9.当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳，在紫外观测仪上进行观察。四、注意事项与实验技巧1.制胶和加样过程中要防止气泡的产生。2.紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。3.EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。4.加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。四、注意事项与实验技巧5.配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。6.梳板的选用：梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。五、跑出好看的电泳图1.凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈；2.一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看；3.上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；4.如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应，中间电场比较均匀；5.做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；6.加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内；7.电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。六、思考题EB的中文名称是什么？EB的作用是什么？使用EB时应注意些什么？怎么制备一块20mL体积1％琼脂糖凝胶（含溴化乙锭溶液终浓度0.5μg/mL）？什么是LoadingBuffer？LoadingBuffer中含有哪些成分？各组分的作用是什么？谢谢！