淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌（amp+）中的表达一、相关背景淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillusoryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类:第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。第三类葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解α-1，4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。还有淀粉α-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。除此之外，不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。耐热性α-淀粉酶，由于使用时温度提高，液化完全，用酶量少，操作比较容易，β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。在制醋工业中，常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本，在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。在医药工业上，β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖，医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。二、目前研究情况1.国内外研究机构由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，国内外很多课题组对它进行了研究。国内主要研究α-淀粉酶的生产菌株及其培养条件；α-淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；淀粉酶的变性机理以及环境对α-淀粉酶的影响；淀粉酶的固定化和动力性质；对多种α-淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。国外有代表性的研究单位有：加拿大的UniversityofBritishColumbia，他们对人胰腺的α-淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦α-淀粉酶结构域与结合位点；美国的WestenrRegionalResearchCenter主要研究大麦的α-淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦一淀粉酶的活性位点。2.国内外α-淀粉酶研究方向第一利用传统育种技术对生产菌进行改良；第二对不同来源的α-淀粉酶的基因进行克隆．表达及酶学性质研究；第三α-淀粉酶结构与功能关系的研究。三、实验研究的目标构建出α-淀粉酶基因，并使其在大肠杆菌（amp+）中进行表达。希望可以通过实验对α-淀粉酶基因的一些功能进行研究。四、简略研究步骤DNA提取——（电泳鉴定）——PCR扩增（引物设计）——（电泳鉴定）——电泳——目标带回收——（电泳鉴定）——连接载体（质粒）——转化大肠杆菌——菌体PCR检测五、相关实验详细介绍ⅠDNA提取ⅡSDS法提取DNA（一）试剂及器材：1．母液：（1）1MTris-HCl：称Tris-Base12.1g，双蒸水溶解，定容至100ml，用浓HCl调pH8.0(pH8.0)。（2）0.25MEDTA：称Na2EDTA·2H2O9.3g，双蒸水溶解，定容至100ml，用NaOH调pH8.0（pH8.0）。（3）2MNaCl：称NaCl11.6g，双蒸水溶解，定容至100ml。2．SDSbulfer：取母液中1MTris-HCl10ml，0.25MEDTA20ml，2MNaCl25ml，定容至100ml，加SDS2g混合。3．5M醋酸钾：称醋酸钾49g，双蒸水溶解，定容至100ml，乙酸调pH4.8。4．TE：(10mMTris-HCl，0.1mMEDTA)1MTris-HCl1ml，40μlEDTA99ml双蒸水。5．3M醋酸钠（pH5.2）：称醋酸钠3H2O40.8g双蒸水溶解定容，固体NaOH调pH至5.2。6．Tris-饱和酚。7．其它：离心机、研钵，7ml离心管，1.5ml离心管，大小枪头，异丙醇，75%乙醇等。（二）步骤：1．取湿菌体约400mg（5ml发醇液），8000rpm，离心5min，弃上清将湿菌体放入研钵中，加液N2(-180℃)约20ml研磨3~5次，2管1.5ml离心管取粉末约0.5ml，各加700μl预热的SDSbuffer，65℃保温1h，7000rpm离心6min取上清。2．加上清2/3体积（约500μl）的5MKAC溶液，4℃，放置30min，12000rpm，离心10min，取上清3．加入等体积的异丙醇，-20℃，2小时以上，或过夜，4℃，8000rpm，离心5min，收集DNA沉淀，75%乙醇洗涤2次，离心管口向下晾干，50μl双蒸水（即ddH2O）溶解。4．Tris-饱和酚，抽提3次。5．加1/10体积的3MNaAc(pH5.2),4℃，放置10min，10000rpm，离心10min，取上清。6．2倍酒精沉淀。7．75%酒精洗2次，凉干，50μl双蒸水溶解。一般情况下，做前3步即可。2电泳（一）试剂及器材：1．50×TAEBufferpH8.51L(2MTris-醋酸，100mMEDTA)称Tris-Base242g，Na2EDTA·2H2O37.2g加800ml双蒸水，充分混匀搅拌，加57.1ml醋酸，加双蒸水定容到1L，室温保存。2．1×TAE（取20ml50×TAE+双蒸水定容至1L）3．电泳仪、大小枪头、离心管，溴化乙淀，mark（d2000）等。（二）步骤：1．取20ml（1×TAE）液体，称0.20g琼脂糖，混合，加热溶化，，倒入插有梳子的电泳槽中，冷却、凝固，2．取出梳子，向槽中倒入TAE溶液至淹没胶块，样品5μl与1μl溴汾兰在塑料皮上混匀后点样入胶孔内（注意不能有泡），加盖，通电，电压100V，电流45mA，40min后，关闭电源。3．打开盖子，倒去TAE，取出胶块，在EB中染色5min，后用蒸馏水漂洗干净，紫外分析仪中（260nm），观察电泳条带。3PCR扩增（一）试剂及器材：DNA提取物，Taq酶，Buffer，双蒸无菌水（灭菌过滤），PCR仪，电泳仪，离心机等。（二）步骤：1．PCR扩增，先设定程序，94℃，3min。（94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min）×30。72℃，5min。及94℃，5min。（93℃，50s；46℃，30s；68℃，1.2min）×35。68℃，7min。2．将双蒸无菌水20μl，Buffer3μl，引物NS11μl，引物NS21μl，dNTP1μl，DNA（模板）3μl及Taq酶1μl依次加入，（Taq酶在冰上加入），总反应时间约2.5小时，反应结束后4℃，冰箱保存。（注意：加引物，dNTP及模板时需换枪头）。3．1%琼脂糖胶电泳作鉴定。剩余的再作电泳，用于回收扩增产物即目标DNA（1%胶更好，大孔梳子）。4目标带回收（一）试剂及器材：回收试剂盒，1×TAEBuffer（pH8.5），电泳仪、大小枪头、离心管，溴化乙淀，mark（d2000）等。（二）步骤：1．PCR扩增产物，用大孔梳子胶做电泳，将目标带用刀片切下估称重量（先称小离心管重量，再称放有胶带的重量，两次相差，即为胶的重量），胶约0.1g加300μlS1溶液，65℃，保温10min，融化完全。2．将300μl的DNA琼脂糖溶液加到一个回收纯化柱上，并把柱子装在一干净的2ml收集试管内，室温下12000rpm离心1.5min。3.加500μlW1洗涤缓冲液，洗涤柱子，静置2min，室温12000rpm离心1.5分钟。4.加500μlW1洗涤缓冲液，洗涤柱子，室温12000rpm离心1.5分钟。5.将空柱室温12000rpm离心1.5分钟，甩干残余液体。6．将柱子装在一个灭菌干净的1.5ml离心管上，加20-30μlT1洗脱液在柱子中心，12000rpm，离心1.5分钟，洗脱DNA。7．取3μl收集的DNA做电泳鉴定，检测是否回收到。5目的基因连接载体（一）试剂及器材：solution[2×buffer，T4DNA连接酶]，载体pMD18-T质粒，纯DNA目标基因片段等。（二）步骤：取纯化的DNA片段13μL（总量约30μL）加质粒载体pMD18-T1.0μL（即25ng），solution6μL(T4DNA连接酶及buffer)，22℃过夜（连接）6转化大肠杆菌a.感受态细胞的制备步骤：⑴.将大肠杆菌接入100mlLB液体培养基中37℃培养3小时，OD600=0.4～0.6（109个/ml）。⑵.将菌液转到50ml预冷管中，冰浴10分钟。⑶4℃4000rpm离心10分钟，收集菌体。⑷管倒置1分钟使微量培养基流尽。⑸每50ml用30ml预冷的0.1M(pH7.2)CaCl2—MgCl2缓冲液（80mMMgCl2,20mMCaCl2）悬浮菌体.⑹4℃4000rpm离心10分钟，收集菌体，管倒置1分钟使微量培养基流尽。⑺每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2（pH7.2）重悬菌体。⑻加入终浓度15-20%甘油分装于小离心管中（每管100-150μl），-80℃贮存备用。b.感受态细胞的转化试剂及器材：IPTG200mg/mL,X-gal20mg/mL,Amp50mg/mL步骤：感受态细胞-80℃取出1管（约150μL），冰上液化，目标基因质粒全部加入感受态细胞，轻弹，插入冰上，冰浴30分钟，42℃热激90s，冷却3-5分钟，加LB（胰蛋白胨10g/L酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0）培养其800μL，混匀，37℃培养1小时（转化），取300μL涂平板，37℃，过夜。7重组子的筛选挑单斑，加入amp终浓度为100μg/ml的液体培养基中16h。菌体PCR检测。实验完成以后，对其结果进行分析，并对α-淀粉酶基因的一些功能进行预测。参考文献1.陈淘声，胡学智.酶制剂生产技术[M].北京：化学工业出版社，1994.2.梁建庆,叶志华,江秀梅,彭李岚,张海滨.转化条件对质粒DNA转化大肠杆菌的影响.微生物学杂志,2004,22(4):15~173.张惠,程继忠,李东,张桂梅,冯作化.质粒转化大肠杆菌方法的改进及受体菌转化效率的观察.同济医科大学学报,1995,24(5):394.陈洪栋,董文博,李红民.一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧.生物技术通报,2009,增刊297~2995.杨依军,李多川,沈崇尧.葡萄糖淀粉酶研究进展.微生物学通报,1996,23(5):312~3156.戴建新,周凤鹃,孙树汉.电穿孔法转化大肠杆菌的影响因素.第二军医大学学报,1999,20(5)7.李南,凌世淦,吴梧桐.电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化.