基因工程菌的构建

分子生物学实验•一、实验设计•二、实验操作•指导教师：林凤••实验设计基因工程菌的构建•载体目的基因酶切PCR扩增，酶切载体片段目的基因片段+连接重组质粒转化重组子阳性鉴定•1、载体多克隆位点•2、缓冲溶液•3、温度•4、末端的性质酶切位点设计载体与目的基因的连接•1、粘末端•2、平末端•3、对照实验连接产物的转化•1、核酸电泳检测•2、对照实验：空白和阳性阳性重组子的鉴定•1、限制性酶切法•2、α-互补法•3、插入失活法•4、杂交筛选法constructionofexpressionvectorNcoICCATGGGGTACCXhoICTCGAGGAGCTC实验操作碱裂解法小量制备质粒DNA-pUC18•接种子液至75µg/mlAmp的5mlLB培养基37℃，OD6001.0加氯霉素100µg/ml37℃，过夜1.4ml培养液4℃,6000rpm,2min沉淀加100µl冰预冷溶液Ⅰ,剧烈振荡弃去上清，尽可能除净培养液室温，20min200µl新配制溶液Ⅱ，快速颠倒混匀冰浴5min150µl冰预冷溶液Ⅲ，温和振荡冰浴5min上清加入450µl饱和酚，混匀4℃,12,000rpm，2min上清加入450µl氯仿-异戊醇，混匀4℃,12,000rpm，2min上清加入300µl异丙醇，-20℃，30min4℃,12,000rpm离心5min500µl70%乙醇洗涤沉淀4℃,12,000rpm，2min弃上清，空气干燥10min20µlTE溶解质粒DNA4℃,12,000rpm，5minDNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定（一）选择合适的水平电泳仪（二）选择孔径大小合适的点样梳（三）制备琼脂糖凝胶（四）用电泳缓冲液溶解凝胶，加入EB达0.5微克/毫升，摇匀，铺胶（五）在电泳槽中加入电泳缓冲液（六）待测的样品中加入指示剂，进行点样（七）打开电源开关，电压控制在5V/cm左右（八）待DNA各条带分开后，电泳结束DNA的酶切与连接•酶切反应体系•12•ddH2O19μl19μl•10×buffer2.5μl2.5μl•质粒DNApBR3223μlpUC183μl•EcoRI0.5μl0.5μl•37℃，1h•65℃，10－15min终止反应•取4μl样品，加入10×Loadingbuffer0.5μl，核酸电泳连接反应体系ddH2O8.5μl10×buffer4.5μl酶切DNApBR32220μl酶切DNApUC1810μlT4DNAligase1μl16℃，15h取10μl连接产物，核酸电泳（上步剩余酶切产物做对照）其余连接产物用于转化重组DNA的转化•（一）CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞•0.3ml菌种接种于30mlLB培养基37℃，190rpmOD6000.375，冰浴10min4℃,6000rpm,10min弃上清，加4ml冰预冷0.1MCaCl2冰浴10min，4℃,6000rpm,10min弃上清,加入1ml0.1MCaCl2，分装200μl/管（二）转化反应分别加入连接产物20µl,阳性对照质粒pBR3221µl,阴性对照pUC181µl,空白对照冰浴30min42℃,90s冰浴1-2min弃500µl上清,连接产物取100µl,10µl各涂一平板,空白，阳性对照和阴性对照200µl各涂一平板加入800µlLB培养基37℃水浴5min37℃，缓慢摇，复苏45min37℃，12-16h观察转化子的出现6000rpm,5min2.转化反应前一天，先倒皿铺好平板3.取以上各组反应物在平板上涂布4.培养皿置于37℃培养箱中过夜5.观察转化子出现的情况（三）倒皿铺平板1.按照各组转化反应的混合物，控制不同的选择性培养基LB固体培养基+Ap（100ug/ml）+Tet（40ug/ml）供连接混合物转化，pUC18转化用LB固体+Ap（100ug/ml）+X-gal（100ug/ml）+IPTG（119ug/ml）供连接混合物转化，pUC18转化用共10皿转化子DNA的快速鉴定（一）制备0.8%琼脂糖凝胶（二）取Eppendorf管，每管加50微升Crackinggel缓冲液（三）用扁头牙签，将菌落刮到Eppendorf管中（四）在37℃水浴中保温15分钟（五）取出各管，4℃，1,500r/min，离心15分钟（六）立即吸出各管上清液25-30微升，进行点样电泳（七）当溴酚兰迁移到凝胶板的2/3处时，停止电泳（八）将电泳凝胶染色30分钟（九）观察质粒的迁移距离，并拍照供进一步分析PCR扩增技术（一）在PCR反应管中加入2×PCRPremix12.5ul（二）向此反应管中加入2ulControlTemplate和10.5ul的PrimerPair1，混匀（三）向反应管中滴加一滴石蜡油（四）按以下条件进行PCR反应：94℃1分钟1次94℃30秒钟55℃30秒钟循环30次72℃30秒钟（五）取8ulPCR扩增液，用2%琼脂糖凝胶进行电泳