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1组织工程2009.11.18xiongyanfei2目录•组织工程学及其发展•组织工程研究内容•组织工程种子细胞研究•组织工程支架材料•组织器官的构建•组织工程面临的挑战2009.11.18xiongyanfei31.组织工程学及其发展•“组织工程学”概念是1987年RobertLanger和JosephPVacanti在由美国科学基金会举办的生物工程小组会上首次提出的，1988年正式定义。•组织工程(TissueEngineering)定义：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科1.1组织工程学概念2009.11.18xiongyanfei4•组织工程是近年来正在兴起的一门多学科交叉的边缘学科，属于生物高技术范畴，它融合了细胞生物学、工程科学、材料科学和外科学等多个学科，必将促进和带动相关高技术领域的交叉、渗透和发展，并由此衍生出新的高技术产业。•组织工程的概念一提出，就受到各国学者的广泛关注，目前，美国已有相当数量的研究机构（包括NASA、DOE、NIH等），许多相关大学（包括MIT、HMS、GIT、UCSD、UMASTFFU）都参与了组织工程的研究。我国也掀起了一股组织工程热，目前已在软骨、骨、肌腱、血管、皮肤、角膜等领域取得了可喜的进展。2009.11.18xiongyanfei51.2组织工程学的发展•组织工程学的建立和发展与很多因素有关：①随着人类物质、文化生活水平的提高，对损伤、疾病的治疗要求越来越高，不仅要求治好伤、病，还要求良好的功能及完美的外形，需要寻找新的治疗途径。②科学技术总体水平的提高，如完善的细胞培养技术和可控降解的高分子材料的问世，为体外构建“组织”、“器官”提供了条件③高、新技术的开发与利用是组织工程学研究的基础，如基因工程技术、免疫隔离技术等为改造细胞提供了新方法。④巨大的市场需求为组织工程学发展注入了动力。众多的投资公司注入大量资本进行组织工程学研究。这些是组织工程学研究发展的基础与动力。2009.11.18xiongyanfei62.组织工程研究内容•组织工程研究包括以下四个方面•种子细胞研究•细胞外基质的研究•组织器官的构建•组织工程临床应用•此外，还须同时进行一下研究•检测方法及检验标准。•临床验证方法及策略研究。•F产业化研究。2009.11.18xiongyanfei7组织工程研究内容•组织工程的核心•建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代•基本原理和方法•将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损部位，随着生物材料逐渐被机体降解吸收，细胞生长、繁殖、分化形成在形态和功能上与相应器官、组织一致的新的组织，达到修复创伤和重建功能的目的。2009.11.18xiongyanfei8•种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自体、同种异体、异种组织细胞等。自体组织细胞应为首选。•现在的研究多集中于以下的几个方面：•载体等技术用于细胞的快速增殖•干细胞工程•采用各种生长因子和端粒酶调节与延缓细胞的老化•采用各种方法（包括自身转化、化学、物理、病毒等）诱导细胞发生转化，使其倍增时间减少，永生化或生命期延长.3种子细胞研究2009.11.18xiongyanfei93.1种子细胞来源3.1.1胚胎干细胞（ESC）:•存在于哺乳动物发育早期胚胎中的（着床前）多能干细胞，具有持续增殖而不分化的能力以及经诱导后可分化形成一个成熟个体中所有类型细胞的潜能。•细胞定向分化的尝试在动物中已取得了可喜结果，神经元细胞、造血细胞以及心肌细胞已在体外获得。•人ESC要真正在人类医学中得到应用，尚需相当长时间。首先，人们还不能有效地诱导干细胞向特定的细胞类型分化；另外，更困难的是，还不能有效地建立无免疫原性的ESC；此外，ESC的应用还涉及到伦理道德方面观念的制约。2009.11.18xiongyanfei103.1.2间充质干细胞:•MSC最初是由Friedenstein发现的一类易于贴附于塑料培养板表面的细胞，它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能。•在机体内MSC存在于许多组织中，尤以骨髓中最多.•MSC用于组织工程研究有以下优势：①取材方便，且对机体无害，简单的骨髓穿刺即可获得；②MSC可取自自体，由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题；③MSC分化的组织类型广泛，理论上讲它能分化为所有的间充质组织类型，如：软骨、脂肪、肌肉及肌腱等。•目前用于分离MSC的方法主要有：密度梯度离心法、贴壁筛选法和流式细胞仪分离法三种。2009.11.18xiongyanfei113.1.3内皮细胞：•内皮细胞应用于组织工程构建，在技术上经历了三个发展阶段：静脉内皮细胞单期种植；微血管内皮细胞单期种植；自体内皮细胞扩增培养种植。Munerett等对动脉和毛细血管系统来源的内皮细胞进行了研究，发现主动脉内皮细胞所形成的毛细血管结构比其他两种细胞形成的结构更稳定持久，更适合成为组织工程种子细胞来源，但是主动脉组织在临床难以获取，最终应用存在一定问题。3.1.4成纤维细胞：来源广泛数量相对较多，便于体外培养与扩增。3.1.5各种成体干细胞2009.11.18xiongyanfei12图a.贴壁筛选的人表皮干细胞接种后呈圆形，细胞体积较小，折光性较强（×400）；图b.人表皮干细胞培养3d时呈明显克隆性生长(×400)；图c.人表皮干细胞培养10d时基本融合(×400)abc2009.11.18xiongyanfei13图1原代培养的人羊膜间充质细胞形态特征(×100)图2原代人羊膜间充质细胞表达波形蛋白（免疫细胞化学染色，×400）2009.11.18xiongyanfei14种子细胞体外培养时存在多问题，需要考虑各种影响因素。•细胞增殖速率、细胞存活期、细胞冻存与复苏、培养细胞与体内生长细胞间的差异等•细胞生长与生存微环境的关系•功能细胞与支持细胞的相互关系•功能细胞与其支持物——ECM的关系•功能细胞的生长繁殖与三维空间的关系•功能细胞的生长繁殖与应力等物理因素的关系3.2种子细胞的体外培养2009.11.18xiongyanfei153.2.1培养细胞的生存期•培养细胞的生存期指细胞在连续传代情况下生存的时间，一般用能传多少代表示。正常细胞都有有限的生存期。如培养的肌腱细胞生存期为13代，软骨细胞为6代，成纤维细胞能传50代。细胞到生存期的末代，表现出细胞生长缓慢或不增殖甚至死亡。•因此，若要保存某细胞，则要在该细胞传代培养的旺盛时期进行冻存。目前世界上常用细胞均在10代内冻存。•另一种保存细胞某种特性的方法是在细胞衰退前对细胞进行转化。转化细胞可形成无限细胞系，但需注意转化后是否还保留了所需特性。2009.11.18xiongyanfei163.2.2加快细胞增殖的方法•组织工程材料在植入体内前需用自体细胞与材料复合，构建组织工程的初级产品。在这一过程中面临的最大问题是细胞增殖缓慢。•目前解决这一问题有两条途径，即具有分化潜能的细胞的诱导和促生长因子的应用。（应用外源性转化生长因子b1和碱性成纤维细胞生长因子促进软骨细胞体外扩增）•在体内情况下，多种生长因子都由机体协调作用，因而是一个多因子序次作用体系：体外如何模仿实施这一多因子序次调节促进细胞生长和分化将是组织工程的另一重大课题。2009.11.18xiongyanfei173.2.3体外培养细胞与体内细胞存在差异•由于体外模仿的技术尚不十分完善，因此目前培养细胞与体内细胞仍然存在着差异。•按照组织工程的需要，可将差异分为两类：功能差异和生长、增殖差异。2009.11.18xiongyanfei18功能差异•细胞体外培养的功能差异指在体外培养条件下，细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功能，即细胞的分化特性减弱或不显著。•细胞在培养条件下的功能降低和丧失对组织工程研究影响十分巨大。因为如果复合的细胞没有其特定功能，则注定不能发挥其应有作用，亦无法构建真正的活材料。因此，必须在改善体外细胞培养环境方面不懈努力，使目的细胞保持其特有的功能。2009.11.18xiongyanfei19生长增殖差异•细胞体外培养的生长、增殖差异指在体外培养条件下，细胞在生长方式、移行方向、增殖能力等方面的改变。•体内绝大多数功能细胞是高分化细胞，或称特化细胞，某一功能高度发达而其他分化潜能相对丧失的细胞，通常代谢相对缓慢，不增殖或增殖十分缓慢，如肌腱细胞。在体外培养条件下，这些不增殖或增殖缓慢的细胞都可以在培养基中成倍的增长甚至传代，这无疑给组织工程大量繁殖细胞带来了方便。2009.11.18xiongyanfei20体外培养细胞与体内细胞产生差异的原因•各种不同的细胞通过特定的方式集合成为组织，再构成器官及机体。每一个细胞在这一体系中均受到统一的神经体液调节和细胞间的相互作用。•被分离细胞置于体外后，失去了机体的神经体液调节，同时，组织中多细胞协同变成了培养中的单一细胞接触，因而细胞间的相互作用亦发生了改变。•众多细胞培养实践表明，细胞生物学及形态的改变程度取决于细胞生存环境因素改变的大小，即体外培养环境接近体内的程度。培养条件越接近，则细胞的生物学行为越接近体内细胞。因此，目前在组织工程研究过程中必须进一步弄清体内细胞间的相互关系。2009.11.18xiongyanfei21体内外细胞增殖分化差异与组织工程的关系•细胞的增殖和分化是细胞生命进程中所获得的基本属性。增殖使细胞数量增多，分化使机体结构和功能多样化，表现在细胞与细胞之间呈现高度的相互依存性和个体细胞相对失去独立性。•细胞由体内移至体外培养，在适宜的条件下，其增殖能力得以提高，同时由于人为控制条件，细胞的分化功能得以保留，这是组织工程构建活材料的基础。•要细胞保持其功能就必须尽可能地模仿体内环境，在保持细胞功能的基础下，为了适应组织工程的需要，还需不断摸索新的培养方法，使细胞增殖更快，并且在应力等物理条件下三维生长，以达到构建活材料的目的。2009.11.18xiongyanfei223.3细胞与材料复合的三维培养•细胞在体内所处的化学和物理环境非常复杂，完全不同于体外普通的单层细胞培养。•细胞的三维培养是指细胞在模拟体内细胞的化学、物理和生物学条件下，在三维基质支架中进行培养。•考虑到体内细胞生长的多因素影响及多细胞相互作用，细胞的复合培养除种子细胞与支架材料的复合外，还包括多种细胞的复合，如种子细胞与基质细胞复合培养2009.11.18xiongyanfei23•组织工程细胞技术可分为三类：①分别提取、分别培养、分层种植。如对内皮细胞和间质细胞分别提取，各自培养，种植时先种间质细胞再种内皮细胞。②混合提取、分别培养、分层种植。一起提取内皮细胞和间质细胞，体外将细胞分离，分别培养扩增，分层种植。③混合提取、联合培养、混合种植。两种细胞一并提取，不分离，联合培养，并一齐无序地种植到支架表面。至于哪种方法较好，目前尚无定论。2009.11.18xiongyanfei24•基质细胞包括其他的疏松结缔组织细胞，在细胞复合培养中充当“饲养”细胞的作用。基质提供复合培养的支架，种植并生长于其中的基质细胞分泌生长因子，以保证种子细胞增殖并使细胞培养长期维持。•基质细胞发生增殖、生长及分泌生长因子，形成类似于在体组织的基质成分。复合培养中基质细胞的三维生长保证了种子细胞的活性增殖。2009.11.18xiongyanfei253.4应力对细胞生长及功能的影响•细胞和组织的生长是一种分子水平上的细胞生物学现象。应力和应变使细胞保持某种特殊的形态，细胞生长决定于这种形态以及其他因素。•体内细胞多在特定的生物力学环境下分裂、增殖，发挥生理功能。•细胞与支架