qPCR实验原理、流程及应用

2011年1月11日星期二定量PCR技术原理、实验设计、应用洪来法FieldApplicationsSpecialist1：蛋白水平检测如WesternBlot、ELISA2：核酸水平检测如Northern、sequence、PCR、qPCR3：其它如多糖水平检测在分子水平对标本的检测方法PCR技术PCR(PolymeraseChainReaction)—聚合酶链式反应1985年K.Mullis发明PCR技术，并因此获得诺贝尔化学奖。1988年伯乐公司推出了第一台PCR仪器PTC-1001998年伯乐公司推出了第一台实时定量PCR仪器iCyclerIQIcyclerIQPTC-100PCR原理三步曲第一步：加热变性靶序列靶序列靶序列引物2引物1靶序列5’5’5’5’3’3’3’3’PCR原理三步曲第二步：退火，引物特异地与靶序列结合靶序列DNA聚合酶引物5’5’3’3’PCR原理三步曲第三步：延伸，DNA聚合酶在引物引导下，按照靶序列复制PCR原理靶序列的大量扩增7循环=128扩增子6循环=64扩增子5循环=32扩增子4循环=16扩增子3循环=8扩增子2循环=4扩增子1循环=2扩增子循环数扩增子数(拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,741,824(10亿)高灵敏度！PCR扩增理论方程N=N0×(1+E)nN:扩增产物数量;N0:起始模板数量E:qPCR扩增效率;n:循环数PCR实际扩增示意图循环数Log(DNA）指数扩增线性扩增平台期样品处理PCR扩增产物分析RealTimePCR定义Real-TimePCR1：PCR技术与RealTimePCR技术的关系PCRvsqPCR+Taq+dNTP+MgCl2+H2O+Buffer+Template+Primer(Onice)•终点法检测•数据会失真•更多人工+2xMasterMix+H2O+Template+Primer(RoomTemp)•实时监控、指数期检测•更加灵敏•无需后期实验处理3hrs(1.5hrslabor)1hrs(20minLabor)通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析2：RealTimePCR技术的定义RealTimePCR定义ƒ1：阀值（Threshold）:指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检测界限。ƒ2：Cq(QuantificationCycle):即为Ct(ThresholdCycle）或Cp(Crossingpoint）或TOP（Top-offPoint）基本概念及其理论qPCR在指数期检测，无需特异控制循环数;而PCR在终点检测，需严格扩增PCR循环数同一个样品的循环数摸索19C22C25C27C30C33C终点定量不均一RealtimePCR重复性高PCRVsqPCR用Ct值进行荧光定量的原理PCR扩增理论方程N=N0×(1+E)nN:扩增产物数量;N0:起始模板数量E:qPCR扩增效率;n:循环数RN=Rb+N0×(1+E)nRsRN:总信号;Rb:背景信号Rs:单位荧光信号当n=Cq时,lgN0=-Cqlg(1+E)+k,(k为计算常数)结论:起始模板的对数值与Cq值成负相关qPCRPCR检测判定的时期完全可以设定到指数期检测终点分析样品后处理无后处理电泳等检测灵敏度（人肝GAPDH）低至0.1pgtotalRNA最低可检测10pgTotalRNA分辨率1000级分子数的质粒DNA还有2倍的分辨率5～10倍左右的分辨率可信的检测范围染料法检测在12～35个Ct能精确定量相差100倍的范围内重现性好较差污染率闭管操作，避免了气溶胶污染开管操作，会污染后期实验数据的判定仪器读书、自动化、结果客观准确有人为因素影响（如上样量、曝光率、光圈范围等）、不能自动化等对样品数限制高通量一般只能比较单次PCR的结果实验操作的复杂性基本上无需特别的反应条件优化要了解基因的表达量，优化cDNA浓度、循环数对实验操作人员的要求只要会操作定量PCR仪即可要对PCR有一定的了解，并能熟练操作10个以内样品实验时间8小时内就能得到结果2～3天才能得到结果PCRVsqPCR－－－小结实时定量PCR检测的化学原理荧光染料嵌合法－SYBRGreenI－EvaGreen)荧光探针法－水解型的探针,如TaqMan－杂交型的探针,如分子信标－Dual-oligoFRET探针荧光染料嵌合法：SYBRGreenI&EvaGreen¾SYBRGreenI是一种结合与所有dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的荧光染料。其是一种不饱和染料¾EvaGreen/LCGreen也是一种结合与dsDNA的具有绿色激发波长的荧光染料,其是一种饱和型染料FluorescenceCycles•Detection•Quantification0302010•Detection•QuantificationFluorescenceCycles•Detection•Quantification0302010AmplificationTemperatureTime(min)051015Temperature(°C)•ProductID•AlleleID908070Fluorescence20MeltingAnalysisTemperature(°C)•ProductID•AlleleID908070FluorescenceAmplification&AnalysisSYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenIMeltCurveAnalysis原始数据导数数据用染料法做完扩增后都需要用融解曲线法来分析产物的特异性SYBRGreen等染料法检测的适用性优势-使用方便、通用性好-检测灵敏度高-方便优化反应条件-染料法相对便宜劣势-需用融解曲线法检测产物特异性-不适合进行多重qPCR检测基于探针的Real-TimePCR工作原理：FRET现象：Fluorescenceresonanceenergytransfer探针法:基于荧光能量共振转移现象TaqMan探针法--两条引物一条探针--探针两端各锚定一个荧光基团TaqprobeexcitationTaqMan探针TaqMan探针TaqMan探针TaqMan探针TaqMan探针检测的适用性优点-杂交效率高-检测特异性强-适合进行多重PCR及基因分型缺点-探针的水解依赖Taq酶外切酶活性，故定量时很受试剂和酶性能影响-淬灭难以彻底，本底较高；-其检测结果很难判定实际的扩增特性多重qPCR的荧光基团选择规则淬灭基团的选择RealTimePCR技术的用途定性分析病毒病原菌检测生物品种鉴定SNP分析等绝对定量基因拷贝数分析病毒病原菌定量分析GMO定量分析等相对定量mRNA表达分析SiRNA效果分析等几乎核酸水平的检测都可以使用RealTimePCR检测技术Real-TimePCR应用qRT-PCRWorkFlow标本准备可为组织、细胞,植物等一切可抽提RNA的标本RNA或DNA可用沉淀法(PureZOL)和离心硅胶柱法(AurumtotalRNAKit)进行抽提cDNA可用iScriptcDNASynthesisKit进行反转录DetectionBio-RadqPCR仪器:如iQ5、CFX96etc.qPCRReagent：SsoFastEvaGreenSupermixetc.2小时1小时2小时实验设计qPCR实验的基石:包括生物性/技术性重复;内参/靶标确定；引物设计;数据分析方法确定,etc.实验设计¾重复性设计¾检测方法学设计¾检测片段查找¾引物设计重复性设计ExperimentControlNTC/NRTetc.-生物性重复：不同的材料（时间、植株、批次、反应板）做的同一实验-技术重复实际上就是同一材料包括的复孔-NTC用来验证实验材料是否具有污染。-NRT是未经反转录的RNA作为阴性对照--阳性对照及阴性对照的设置Statisticalaspectsofquantitativereal-timePCRexperimentdesign,Methods(2010)50:231–236重复性设计检测方法学确定－－常见试剂分类¾按检测手段分类------染料法和探针法¾按检测步骤分类----一步法和二步法检测染料法---(iQSYBRGreenSupermix)探针法---iQSupermix一步法－－iScriptOne-StepRT-PCRKitforProbes二步法---iScript™cDNASynthesisKit+iQSupermix¾按聚合酶的修饰方式分类¾按使用染料进行分类抗体修饰－－SsoFastEvaGreenSuperMix化学修饰－－QuantitectSYBRGreenPCRkit饱和染料－－SsoFastEvaGreenSuperMix不饱和染料---(iQSYBRGreenSupermix)检测方法学确定－－常见试剂分类以DNA为检测材料时,可直接对抽提的DNA模板就行qPCR检测即可以RNA为检测材料时，需把RNA反转录成cDNA后再进行qPCR检测¾一步法qRT-PCR检测:适用于病毒、病原菌检测9操作简便9污染率低¾两步法qRT-PCR检测:常用于mRNA表达量差异分析9两步法检测效率高9制备的cDNA通用性强9cDNA可长久保存检测方法学的确立检测序列查找(GenBank)数据资源序列比对NCBI基因搜索结果-----CCL26（人脐静脉内皮细胞HUVEC）引物设计---核酸二级结构分析Multiplesecondarystructures@55°C@65°C二级结构的影响及引物位置11110110ForwardPrimerReversePrimerAPrimerBReversePrimerBPrimerB:η=95.8%PrimerA:η=66.3%PrimerA在线引物设计软件，结合二级结构分析软件能高效的设计qPCR引物引物设计----在线免费设计软件BeaconDesigner：9在线连接数据库9mFold,etc9Multiplexassays引物设计----全功能型的在线引物设计软件引物设计--RNA中混有GenomicDNA的策略主要针对基因的表达量检测‡qPCR引物进行跨内含子设计‡使用DNaseI（RNaseFree）处理抽提的RNAGenomicDNA:ExonIntronExonmRNA:ExonExonNoproductProductqRT-PCRWorkFlow标本准备可为组织、细胞,植物等一切可抽提RNA的标本RNA或DNA可用沉淀法(PureZOL)和离心硅胶柱法(AurumtotalRNAKit)进行抽提cDNA可用iScriptcDNASynthesisKit进行反转录DetectionBio-RadqPCR仪器:如iQ5、CFX96etc.qPCRReagent：SsoFastEvaGreenSupermix2小时1小时2小时实验设计qPCR实验的基石:包括生物性/技术性重复;内参/靶标确定；引物设计;数据分析方法确定,etc.二.标本准备¾标本来源：可为组织、细胞、植株、FFPEetc.一切可以抽提到核酸(如RNA)的标本¾标本收集(以RNA为例)：a.组织/植物标本---取新鲜标本需立即用液氮速冻后放-80℃保存b.细胞标本---贴壁细胞可用胰酶消化后后再离心收集，也可用TRIzol直接裂解细胞收集裂解液;悬浮细胞可直接离心收集qRT-PCRWorkFlow标本准备可为组织、细胞,植物等一切可抽提RNA的标本RNA或DNA可用沉淀法(PureZOL)和离心硅胶柱法(AurumtotalRNAKit)进行抽提cDNA可用iScriptcDNASynthesisKit进行反转录DetectionBio-RadqPCR仪器:如iQ5