核酸检测培训

核酸检测北京万泰研发中心2010.04.12主要内容为什么要做核酸检测？核酸是什么？怎样进行核酸检测？市场状况为什么要做核酸检测？核酸检测（基因检测）现知人类的疾病都与基因有直接或间接的关系。医学实验室所要检测和分析的核酸既包括人体本身的基因(DNA)以及反映基因转录水平的mRNA,也包括侵入人体的致病微生物等所携带的外源性基因(DNA/RNA)。传统检测试剂（酶免ELISA）技术特点：检测目标为蛋白,所检测的主要是疾病所引发的人体抗体而不是病原体本身,是一种间接、滞后的检测方式。易操作，成本低。固有不足：不能够消除对“窗口期”标本(抗体阴性,核酸阳性)的漏检难于检测病原体的不同亚型及突变型不典型血清阳转对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检核酸检测显著缩短窗口期:HIV窗口期缩短45%，HCV缩短89%，HBV缩短50%。提高灵敏度:理论上扩增体系中单拷贝的模板也能被检测出。特异性好:使用荧光探针技术的PCR检测，几乎没有方法学的假阳性。直接揭示病原体的存在对操作者及检测环境的要求较高检测成本相对较高输血中可传染病原体的“窗口期”病毒种类ELISA检测项目窗口期HCV抗-HCV2.0/3.0EIA8-10周HIV抗-HIV-1/2EIAandHIV-1抗原EIA2-4周HBVHBVsAgEIAandHBVcAgEIA6-8周HTLV抗-HTLVI/IIEIA8-10周CMV抗-CMVEIA3-5周窗口期检测率国家或地区HBVHCVHIV加拿大1:153000(~1/15万)1:2300000(~1/230万)1:7800000(~1/780万)法国1:640000(~1/64万)1:10000000(~1/1000万)1:3150000(~1/315万)德国1:230000(~1/23万)1:670000(~1/67万)1:2770000(~1/277万)日本（50混）1:51988(~1/5.2万)1:348091(~1/35万)1:2668696(~1/267万)美国（24混）1:180000(~1/18万)1:230000(~1/23万)12:37164054(~1/309万)香港1:32786(~1/3.3万)1:5456(~1/0.5万)1:222(~1/0.02万)核酸检测在临床诊断中的应用定性诊断血液筛查病原体筛查诊断SNP和耐药突变诊断基因型分型遗传病诊断个体用药诊断基因鉴定和配型……………定量检测病情的评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察新药验证癌基因表达差异……………核酸是什么？核酸（NucleicAcid）是一种主要位于细胞核内的生物大分子，其充当着生物体遗传信息的携带和传递。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。核酸分类：DNA、RNA；DNA：dATP（A）、dTTP（T）、dCTP（C）、dGTP（G）；RNA：ATP、UTP、CTP、GTP；3’5’磷酸键DNA结构单链DNA形成双链的原则—碱基互补配对：G-CT-A外部为磷酸和戊糖形成的骨架内部为碱基互补形成的共价结合区域螺旋结构核酸在体内的复制DNA的热变性DNA受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温会恢复双链状态怎样进行核酸检测？核酸检测的一般流程核酸样品的制备：从血液、体液、组织中提取或PCR扩增样品的检测：核酸杂交、PCR、荧光定量PCR、PCR-ELISA等结果判读：电泳、膜、荧光定量PCR仪等核酸杂交核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southernblothybridization）和RNA印迹杂交（Northernblothybridization）。核酸提取PCR扩增探针点膜交联杂交显色结果判读PCR聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA的复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR的产生实时荧光PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行分析的方法,可以进行定量和定性检测。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Amplifluor(Intergen)SYBRGREEN双探针杂交分子信标Taqman引物特异探针性质可逆荧光积累荧光熔点分析能不能特异性引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）引物＋2探针引物＋探针引物＋探针引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）探针无有有有无通用性通用专用专用专用专用探针特点SYBRGreen融解曲线分析SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA􀂉使用方便--不必设计复杂探针􀂉非常灵敏􀂉便宜TaqMan探针法TaqMan法优缺点市场状况生产厂家检测项目使用技术使用仪器达安基因HBV、HIV、HCV、HPV、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、单纯疱疹病毒Ⅱ型、ɑ－地中海贫血、缺失型β-地中海贫血、淋球菌、血筛试剂PCR荧光探针法PCR-反向点杂交法荧光定量PCR仪PCR仪上海科华HBV、HCV、新型冠状病毒、血筛试剂PCR荧光探针法PCR-酶免荧光定量PCR仪酶免相关仪器匹基HBV、HIV、HPV、TB、HCV、沙眼衣原体、新型冠状病毒PCR荧光探针法荧光定量PCR仪上海华美HBV、HCV、TB、沙眼衣原体、新型冠状病毒PCR荧光探针法荧光定量PCR仪上海克隆HBV、TB、HPVPCR荧光探针法荧光定量PCR仪凯普、港龙以HPV检测为主。浩源血筛试剂已进入审批阶段。罗氏、生物梅里埃公司有HIV检测试剂盒，均以各自公司的专利技术为主研发。现状和趋势1、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操作为主；缺乏规范；核心技术少；2、趋势：管理部门逐渐加强管理，相关标准制订中；进口试剂以全自动诊断平台为主在国内推广，国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器进入市场；实时荧光PCR检测的难点1、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术2、适合筛查应用的多重PCR技术3、高通量全自动的核酸提取设备和耗材4、高通量检测设备和配套耗材的成本控制5、质量控制和质量管理方法6、核心原料的成本控制试剂质量控制方法1、实验室分类和功能化2、人员培训和自我约束3、建立切实可行的质量控制方法和管理体系