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1国家继续教育学校班教材内分泌代谢病基础与临床上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢科上海市内分泌代谢病临床医学中心2单基因遗传性内分泌代谢病基因诊断的临床应用宁光摘要：本文较为详细介绍单基因遗传性内分泌代谢病的分类方法、主要的诊断技术临床诊断流程，并探讨基因诊断技术在单基因内分泌代谢病中临床应用的可行性。遗传性内分泌代谢病是一古老的疾病，早在1896年，Pendred描述家族性的甲状腺功能减退症、甲状腺肿大和耳聋综合征，开始了以家系调查来研究内分泌遗传病的工作。以往，此类疾病的诊断主要依赖临床表型分析和生化检查并结合其遗传模式，1959年，Jacobs等发现Klinefelter综合征病人的核型是47，XXY，这一工作使染色体和细胞遗传学得到了全世界的承认，标志着内分泌病的诊断率先进入了细胞遗传学水平。自上世纪八十年代，随着分子生物学技术的发展，相当多的遗传性内分泌代谢病的致病基因相继发现，越来越多的单基因突变所致的内分泌代谢疾病被发现，此领域取得突破性进展。遗传性内分泌代谢病虽然在总人数上并不多，但病种繁多、涉及的组织器管众多、诊疗异常困难，成为内分泌代谢病领域最考验临床水平的一类疾病，以往此类疾病多用临床表型、生化检测、激素或酶的底物或产物量或其比值的改变来诊断，其诊断程序复杂，而不确诊率甚高。因此，在分子生物学技术达到足以发现内分泌代谢病的基因缺陷的水平时，许多实验室工作者在花费大量时间和经费去探测遗传性内分泌代谢病致病基因的同时，力图将实验室工作应用于临床，将其实验室的成果转化为临床可用的诊断手段，目前此类转换型医学理念指导下的遗传性内分泌代谢病的基因诊断正方兴未艾。单基因遗传性内分泌代谢性疾病的发病率虽然不高，但由于其致残和致死率高，诊断和治疗困难并复杂，且有遗传性，因而对其做出明确诊断尤其是基因诊断尤为重要而且基因诊断是临床怀疑遗传性疾病的最准确诊断方法。其次，基因诊断可对家族中其他成员是否发生同样病症做出预测，并能对尚无临床表现的致病基因携带者是否发病做出预测；第三，基因诊断可作为人群大规模筛查的指标，发现尚未出现症状的患者；第四，由于我国人口基数大，病人绝对数量多，这将使我们开展这一类遗传疾病的分子发病机制，以及后续研究提供无法估量的宝贵的基因资源优势；第五，基因突变检测技术平台的建立以及大量突变数据库的累积，将为今后对这类患者进行基因诊断、遗传咨询、产前诊断及针对基因突变的基因纠正治疗奠定基础。3一、单基因遗传性内分泌代谢病的分类方法：此类疾病病种繁杂、临床表现和致病机制各异、涉及的组织器官众多，因此，统一而全面的疾病分类方法非常重要。根据本课题组的积累，并参考已有的遗传性内分泌代谢病的分类方法，我们提出一改良的、按致病基因及其功能的分类方法：1.癌基因和抑癌基因：如同其它肿瘤一样，癌基因和抑癌基因在遗传性内分泌肿瘤中起重要作用。如MEN1抑癌基因突变造成MENI，RET原癌基因突变造成MENII型。2.肽类激素基因突变：基因突变使编码的多肽激素生物学活性发生缺陷，从而发生内分泌功能减退，包括生长激素、TSHβ亚基、LHβ亚基、甲状旁腺激素和胰岛素基因发生突变导致的相应内分泌功能减退。3.激素膜受体基因突变：又可分为2亚型，一是大多数突变使受体活性下降，信号传导障碍，从而引起相应的激素功能减退症，如TSH、ACTH、LH、GH等受体突变引起的各类激素功能减退症；促黑素4型受体（MC4R）基因突变阻断了α-MSH对食欲的抑制效应，导致严重肥胖。二是少数突变使受体在无激动剂存在的情况下也处于激活状态，引发内分泌功能亢进。如TSH受体和LH受体基因发生的激活性突变则分别引起高功能性甲状腺结节伴甲状腺功能亢进和家族性男性性早熟等。4.激素核受体基因突变：即类固醇激素受体超家族基因突变所致，使机体无法发挥配体调控的基因转录，从而出现相应激素不足的表现，包括雄激素抵抗综合征、家族性维生素D抵抗性佝偻病和甲状腺激素抵抗综合征等。5.激素信号传递系统中的组成蛋白基因突变：分为2亚型，一是效应降低型，如葡萄糖激酶基因突变使肝脏和胰岛β细胞中的葡萄糖磷酸化受阻，影响胰岛素效应的发挥导致MODY2；葡萄糖-6-磷酸酶基因缺陷造成的糖原累积症；G蛋白α亚基基因突变，导致一些与G蛋白偶联的激素如甲状旁腺激素、TSH、LH、FSH不能发挥效应，造成激素抵抗；二是效应增加型，GTP酶基因突变，使G蛋白持续兴奋，则造成内分泌功能亢进，如垂体GH瘤等；cAMP依赖性蛋白激酶Aα调节亚基(PPKAR1A)基因突变导致Carney综合征。6.离子通道蛋白基因突变：此类基因缺陷使相应的离子通道无法正常工作，造成所谓的离子通道疾病，如肾小管水通道蛋白基因突变造成的肾性尿崩症、Liddle综合征；钠、钙通道蛋白基因突变造成的低钾性周麻等。7.激素合成原料转运蛋白基因突变：此类基因突变也会影响相应激素的合成，造成相应激素缺陷。如类固醇生成急性调节蛋白（StAR）的主要功能是将类固醇从线粒体外膜转运到线粒体内，参与类固醇激素的合成，是类固醇激素合成的限速步骤。该基因突变可引起类脂性先天性肾上腺皮质增生。8.合成激素所需酶基因突变：类固醇激素合成过程中需要一系列的酶，酶基因突变导致相应的酶缺陷，发生类固醇激素合成障碍。包括20,22碳裂链酶，17α-羟化酶（CYP17），3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD），21羟化酶（CYP21），11β-羟化酶（CYP11B）的基因突变导致的酶缺陷均可导致先天4性肾上腺皮质增生症，临床表现为各种相应激素的缺乏。9.转录因子基因突变：转录因子调控激素基因以及激素效应基因的转录，如果发生突变，则可导致激素基因表达异常和激素生物效应发生障碍。如肝细胞核因子（HNF）4α、HNF1α和HNF1β突变导致的MODY1、MODY3和MODY5；睾丸决定因子基因（SRY）突变导致的两性畸形。二、单基因遗传性内分泌代谢病诊断技术：随着分子生物学技术的进展，单基因遗传性内分泌代谢病的基因诊断技术水平也明显提高。这不仅使诊断的准确率明显提高、费用明显下降，而且所花费的时间也大大缩短。1.基因测序确定基因突变：对于致病基因明确的遗传性内分泌疾病，多采用PCR直接扩增测序的方法确定突变位点，部分还行亚克隆转染载体后证实。本项技术已经成为非常成熟的技术平台，而且可快至1星期内得到结果，因而使临床应用成为可能。如针对有多个内分泌腺体腺瘤样改变的病人进行MEN1基因突变筛查，并对手术切除组织标本进行MEN组化染色和RNA转录本检测；。2.对于致病基因不明确的疾病使用定位候选克隆的策略：首先运用连锁分析或其它方法,将一个新的致病基因在染色体上精确定位；然后从计算机数据库中将同样定位于这一染色体区域上的基因或cDNA的功能结构域、序列稳定性、表达时空特异性以及发育与遗传对表达的影响等资料调出,与这一疾病的生化改变、受累组织遗传特征、发育缺陷等特征进行比较，分析确定候选基因；最后在患病个体中筛查该基因是否发生结构异常,以及这种结构变化是否导致功能改变,从而确定或排除该候选基因。我们在一个显性遗传性中枢性尿崩症的家系中未发现AVP-NPII基因任何突变位点后，通过定位候选克隆策略，成功地把致病基因定位于D20S199–D20S849之间的区域，虽然确切的致病基因尚未确定，但为深入探讨显性遗传性中枢性尿崩症临床表型的异质性和机体的水代谢过程奠定基础。3.杂合性丢失(lossofheterozygosity，LOH)分析：LOH现象是指来自父亲或母亲一方的等位基因发生了缺失，缺失的区域从几千个核甘酸至整条染色体不等。虽此现象是一个低概率事件，但发生后会对细胞生存有影响，若缺失片段中含抑癌基因，则导致肿瘤。但由于抑癌基因是显性的，所以只要一对同源染色体中有一条染色体有抑癌基因的表达就可以抑制肿瘤的发生。但若另一染色体发生突变而失活时，则细胞就会恶性增殖，形成肿瘤，此即肿瘤发生的二次打击（two-hit）假说。本课题组用微卫星分析方法对3例MEN1的所涉及的肿瘤进行分析，发现很多肿瘤组织中都存在MEN1基因位点的LOH。对26例嗜铬细胞瘤的组织标本进行LOH分析，发现30.8%的肿瘤组织存在11q23的LOH，26.9%的肿瘤组织存在11q13的LOH，同时排除了SDHD和MEN1基因突变的可能，结果提示11q存在除SDHD和MEN1之外的与嗜铬细胞瘤发生相关的基因。4.表观遗传学：是指DNA序列未变化，但基因表达却发生了可遗传的改变，这种改变是细胞内除遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，包括DNA修饰、蛋白修饰和非编码RNA的调控等，这种改变可在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传学研究包括染色质重塑、DNA甲基化、X染色体失活5和非编码RNA调控等，研究方法包括经典遗传学的方法、组蛋白乙酰化测定、DNA甲基化测定技术和CpG岛（CGIs）微阵列技术、RNA干扰以及microRNA等。本课题组使用重亚硫酸盐直接测序的方法发现某些激素的异位过多表达与其启动子区的甲基化程度降低相关，为深入理解异位激素综合征的发病机制以及临床治疗提供了新的药物靶点。5.生物信息学（bioinformatics）：是将生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互融合而成。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而达到揭示数据所蕴含的生物学意义的目的。本研究首先采用PCR产物直接测序的方法将生物学信息加工和整理转化为计算机能够处理的数字信息，并与NCBI数据库及HGMD（theHumanGeneMutationDatabase）进行比对，证实1例临床表现轻微的17-羟化酶缺陷症病人的CYP17A1基因1418TC所致F453S位点的突变是一种新的基因突变。继而，应用生物信息学软件SIFT（SortingIntolerantFromTolerant），对不同物种间具有相同功能的P450c17蛋白所编码的氨基酸序列进行了比较，并对引起不同临床表型的突变位点对蛋白功能的可能影响进行了预测，从进化的角度来观察该突变位点与疾病关系。结果显示，从小鼠、大鼠、犬、羊、猪、猿到人类，F453位点都是一致的，证明该位点在生物进化过程中的保守性以及对蛋白功能的重要性。但是F453S的预测值为0.78（p0.05），提示该突变对蛋白功能影响较小。而其它具有典型临床表现的突变位点预测值均小于0.05。为了揭示该位点突变对蛋白功能影响的机制及程度，我们利用多种生物学软件构建了新的P450c17的计算机模拟三维结构。采用Genthreader软件对现有的PDB（ProteinDataBank）相关蛋白进行了筛选，确定以哺乳动物蛋白CYP3A4（PDB递交号码为1tqn）的X线天然衍射结构为模板；利用Modeller进行了三维结构的重建，从5个候选结构中最终确定了能量最低的新构像，并采用Procheck和ProsaII对该三维构像进行了立体结构、蛋白总体势能等多方面质控评价。最后利用Deepviewer进行了该突变位点对蛋白三维结构以及功能的可能影响。F453位于靠近蛋白重要功能辅基血红素的一个笔直的α螺旋的中部，苯丙氨酸的苯环是游离的，没有与任何其他的氨基酸形成化学键。而当苯丙氨酸突变为丝氨酸时，即与449位的精氨酸形成了新的氢键，这就有可能使得原本笔直的α螺旋出现轻微的背曲，轻微地影响到血红素的结合，从而对蛋白的功能构成一定的影响。三、单基因遗传性内分泌疾病诊断流程：为了将实验室的结果转换为临床可用的诊断技术，建立临床诊断流程，确保诊断过程的安全、准确和继是非常重要，同时还应降低费用，形成一定规模型的测定。1.临床资料的收集和临床诊断的确定:首先需要准确、全面收集先证者及其家系成员的临床资料和建立完整的家系图谱。完整准确的临床资料对基因诊断有极大的帮助，尤其要注意家系的收集，遗传性缺陷常常在一个家系中会有几代人患病。尽可能找到家系中的所有成员，绘制标准的遗传家系6图，采集完整的临床资料，生化检查结果，全血DNA标本以及手术切除的组织标本。然后根据临床表型确定诊断。2.致