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第八章植物种质资源的保存种质(germplasm)是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。植物种质资源(plantgermplasmresources)即为携带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。种质资源保存(germplasmconservation)是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。种质资源保存的必要性：种质资源或称基因库是选育新品种的最基本的原始材料。有人说：“人类的命运将取决于人类理解和发觉植物种质资源的能力。”植物种质资源的多样性由于自然灾害和人为活动受到严重影响，作物品种资源日益匮乏。拥有妥善保存多种多样的种质资源成为人类十分关注的问题第一节种质资源保存类型种质资源的保存方式有两种，即原生境保存和非原生境保存。原生境保存（原地保存）：将植物的遗传材料保存在它们的自然环境中。原生境保存的地方多是植物保护区，另一种方法为农田种植保存。湖北神农架国家级自然保护区新疆哈纳斯扎龙国家级自然保护区九寨沟国家级自然保护区非原生境保存（异地保存）：将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物园、种质圃、种子(质)库、试管苗库、超低温库等。具体保存方法有四种：种植保存、贮藏保存、离体保存和基因文库保存。华南植物园贮藏库野外保存植物种质资源需要大量的土地和人力资源，成本高，且易遭受各种自然灾害的侵袭。种子库只能保存正常型种子，对于顽拗型、脱水敏感的种子和有性繁殖困难的植物则无能为力，而且种子库仅能保存基因，而不能保存特定的基因型材料。自1975年Henshaw和Morel首次提出离体保存(conservationinvitro)植物种质的策略以来，该项技术受到植物界的极度重视。第二节种质资源离体保存种质资源的离体保存(germplasmconservationinvitro)：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。离体保存的意义可使一些无性繁殖作物种质资源低温长期保存，避免资源的丢失。节省土地和劳力，方法简单，花费少并能在保存中脱毒。一旦利用可快速繁殖；也利于种质交换。离体保存方法：低温保存超低温保存生长抑制剂保存（一）低温保存一种缓慢生长保存方法，是通过控制培养温度（非冰冻低温）来限制培养物各种生长因子的作用，使培养物生长减少到最低限度。低温保存的植物离体材料类型：试管苗、愈伤组织、花粉、茎尖等。低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养，不断繁殖更新；基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。延缓保存材料生长速度的另一项措施是改变培养基的成分，在培养基中添加生长延缓剂或生长抑制剂，如ABA(脱落酸)、CCC(矮壮素)、PP333(多效唑)、B9(比久)、MH(青鲜素)等。种质库要定期检查，保持清洁，及时清除污染材料，并注意积累资料。（二）超低温保存1.种质资源超低温保存的发展概况20世纪70年，Nag和Street首先证明胡萝卜悬浮培养细胞在液氮中保存后能恢复生长。植物超低温种质保存(cryopreservation)是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮）条件下进行保存的方法。其中，茎尖、胚、幼苗等材料遗传性稳定、再生力强，对冷冻和解冻过程中所产生的斜坡忍受能力强。极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。同时，由于超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。2.种质资源超低温保存的原理超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？细胞冰冻结冰保护性脱水理论溶液的玻璃化理论细胞冰冻结冰保护性脱水理论常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结”出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程称为保护性脱水。当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。溶液的玻璃化理论溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度足够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。提高超低温冷冻保存的措施由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。冷冻防护剂防护机理：۩在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。۩冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。常用的冷冻防护剂渗透型冷冻防护剂:多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。包括二甲亚砜（DMSO)、甘油、甘露醇、脯氨酸、乙二醇、丙二醇非渗透型冰冻保护剂:是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。常见的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingylpyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羟乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)3.超低温保存的基本程序植物材料（培养物）的选取材料的预处理降温冷冻及超低温保存解冻：分快速解冻、慢速解冻再培养超低温保存后细胞或组织活力检测植物材料（培养物）的选取物种、基因型、器官、抗寒性、年龄、生理状态等。植物细胞培养物的生理状态是决定冻后细胞成活率的重要因素。一般指数生长期和生长延滞后期的细胞抗冻力强，存活率高。植物材料（培养物）的预处理为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，还要对材料进行预处理，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞抗寒力。目前主要有3种预处理方式：（1）低温锻炼激活植物体内抗寒机制（2）继代培养增加有丝分裂细胞数目（3）预培养培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质植物材料（培养物）的冷冻处理降温冰冻方法是影响超低温保存效果的关键因素之一。冷冻的4种方法快速冷冻法慢速冷冻法分步冷冻法干燥冷冻法（1）快速冰冻法将材料从0℃或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在1000℃/min以上。这个过程可以使细胞内的水分子还未来得及形成结晶中心就降到了-196℃的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱水的材料，如种子等。要求细胞体积小、细胞质浓厚、含水量低、液泡化程度低的材料。（2）慢速冰冻法将处于0℃或其他预处理温度的材料以1-2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃，稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连续降温至-196℃的方法。逐步降温过程可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞内结冰。这种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如悬浮细胞、原生质体等。（3）预冷冻法分步冰冻法此法将快速和慢速2种冰冻方法结合起来。首先用较慢的速度（0.5～4℃/min）使植物材料从0℃降至一定的预冷温度（一般为-40℃）并停留一段时间（一般10min左右），使细胞进行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷冻。逐级冰冻法植物材料经过冷冻保护剂0℃预处理后，逐级通过-10，-15，-25，-35，-40℃等，每个温度停留10min左右，然后浸入液氮。（4）干燥冰冻法将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮；或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔中进行慢冻。只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适，但对大多数对脱水敏感的材料不适用。植物材料（培养物）的冷冻贮藏适宜温度下贮存冷冻材料也很重要。长期内贮存在液氮内的材料，需合适的液氮容器。冷冻贮存的茎尖随保存时间的延长，其生活力可能下降。植物材料（培养物）的解冻处理植物材料在超低温贮存过程中所发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产生的。解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成的。解冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系造成破坏。解冻方法快速解冻法慢速解冻法a、快速解冻法是指将液氮中保存的材料直接投入到37-40℃温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度为500-750℃/min，大多数植物材料可采用此种方法。b、慢速解冻法将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。适宜细胞含水量较低的材料。如木本植物的冬芽。化冻后的材料需立即进行洗涤，以除去材料组织中高浓度的冷冻保护剂，避免影响材料恢复和继续生长。最常用的洗涤方法是用含浓度为1.2mol/L蔗糖的基本培养基25℃下处理10min，也有用浓度为1.5～2.0mol/L的山梨醇的培养液进行保护剂成分的洗涤植物材料（培养物）的再培养经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养1～2周，在转入正常光下培养。再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等以利于生长的恢复。组织材料预处理加冷冻防护剂0℃慢冻法-40℃或-100℃预冻法-70~-20℃快冻法种质库（-196℃）迅速解冻（34~40℃）再培养细胞生长、植株再生超低温保存的程序超低温保存后细胞或组织活力检测冻后存活率的快速鉴定通常采用FAD荧光双醋酸法、TTC(氯化三苯四氮唑)还原法、Evans(伊凡蓝)法等。存活率公式存活率（%）=×100%重新生长的细胞（组织）数解冻的细胞（组织）数（三）生长抑制剂保存1)高渗保存法利用培养基的高渗透压，减少离体培养物吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程，从而减缓生长速度，达到抑制离体培养材料生长的种质保存方法。高渗物质：甘露醇、蔗糖、PEG等高渗保存配合低温效果更明显如：6~10℃低温下，培养基中加4%甘露醇，可保存马铃薯1~2年，存活率最高可达90%以上。2)生长抑制剂保存法在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。生长延缓剂：ABA、青鲜素、CCC、多效唑、B9等使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率高。3)抑制生长的其他保存法低压保存法：降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的，分为低气压与低氧压两种，保存原理相似。饥饿法：从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量干燥保存法：减少培养材料的含水量矿物油覆盖法：使培养材料与空气隔绝，延缓生长低光照培养：