第九章-植物种质资源离体超低温保存-(2-学时)

华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学文本教案(第九章)主讲教师：柳俊博士、教授第九章植物种质资源离体超低温保存（2学时）教学目的与要求：了解植物种质离体保存的类型与特点；了解超低温保存的特点与方法；植物植物种质低温保存的基本操作技术。第一节概述一、植物种质资源低温保存意义防止资源灭绝节约人力物力便于交流二、超低温保存的概念种质资源低温保存（cryopreservation）是由cryo和preservation组成，在英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。习惯上，人们将－80ºC以下的低温称为超低温，干冰温度（－70ºC）称为极低温，低温则从4ºC往下推（李广武等，1998）。对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在－6.5ºC，枳壳通常在－20ºC左右（沈德绪等，1986）。目前常用的超低温保存方法可分为两类，即冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存。在超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。三、超低温保存的研究概况1．超低温保存技术的发展2．用于离体超低温保存的植物材料3．超低温保存的植物种类超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。第二节植物材料超低温冻存的细胞学基础一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60～90％。细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易冻结。由于细胞内含有复杂的化合物，细胞内的溶液并不象纯水那样在0ºC左右结冰。华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学文本教案(第九章)主讲教师：柳俊博士、教授理论上讲，细胞外水的冻结温度为－5～－15ºC，细胞内游离水的冻结在－25ºC。－30ºC时，细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，而结合水在－100ºC温度下也不冻结。根据Luyet的冻结理论（Luyet1937），细胞游离水的冻结温度（－30ºC）可被认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法是以－30ºC为基础的。控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。二、植物细胞超低温保存过程中的致死损伤细胞超低温保存有三个重要操作步骤：一是细胞预冻；二是细胞在－196ºC下长期贮存；三是细胞解冻。植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上。种质超低温保存成功的关键，在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰。为此，针对不同种类的植物材料，筛选适合的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式，可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。第三节超低温保存的方法超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力和变异的评价、植株再生等几个步聚。一、传统的降温冰冻方法1．快速冰冻法2．慢速冰冻法3．两步法4．逐级冰冻法二、玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。1．玻璃化法玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后，直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。保存终止后，复温时要快速化冻，防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口，就可保证冻存的成功。2．包埋玻璃化法包埋玻璃化法是包埋－脱水法和玻璃化法的结合。保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保存，其材料存活率比用包埋—脱水法要高，可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。三、其它超低温冻存方法华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学文本教案(第九章)主讲教师：柳俊博士、教授1．干燥法（desiccation）2．预培养法（pregrowth）3．预培养-干燥法(pregrowth-desiccation)4．包埋脱水法（encapsulation-dehydration）第四节影响超低温保存效果的主要因素一、材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。二、预培养和低温锻炼预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。三、冰冻保护剂的应用　　一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。所以，生物体的低温保存离不开冰冻保护剂（cryoprotectiveagent，CPA）。冰冻保护剂也称作抗冻剂，合理地选择冰冻保护剂，对低温保存至关重要。冰冻保护剂应具有以下特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的作用主要表现在增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长。　　渗透型冰冻保护剂：多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。常用的渗透型冰冻保护剂有甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但渗透型冰冻保护剂使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同，如甘油适宜于慢速冷却，而DMSO却易于渗入细胞，并在常温下稍有毒性。　　非渗透型冰冻保护剂：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。非渗透型冰冻保护剂主要有聚乙烯吡咯烷酮（polyvingylpyrollidone，PVP）、蔗糖（sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，dextrane）、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）、白蛋白（albumin）、羟乙基淀粉（hydroxyethylstarch，HES）等。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。四、化冻方法液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。生长季节中的材料，一般在37～40ºC温水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0ºC低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学文本教案(第九章)主讲教师：柳俊博士、教授玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成的伤害。五、再培养　　经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养1～2周，再转入正常光下培养。再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。第五节超低温保存过程中的遗传变异及其检测技术无论哪种种质资源的保存方法都是以保持物种原有的遗传特性为出发点。在超低温保存过程中，植物材料是否发生变异是育种工作者十分关心的问题。在超低温保存之前，外植体材料、培养继代时间、培养基成分以及自然突变等因素都可能影响到保存材料的遗传稳定性。为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。目前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记如RFLP和RAPD等检测方法常常单独或结合起来用于遗传变异分析。思考题1．植物离体超低温保存的概念及常用的超低温方法。2．植物材料超低温保存的细胞学基础。3．超低温保存的方法及其技术要点。4．影响超低温保存效果的主要因素及调控措施。