磷酸钙转染

[实验目的]1了解细胞转染技术原理和基本方法2磷酸钙沉淀法的基本技术要点[实验原理]磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和vanderEbb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。[仪器、材料和试剂]1呈指数生长的真核细胞（如HeLa,BALB/c3T3,NIH3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞）2完全培养液（依所用的细胞系而定）3CsCl纯化的质粒DNA（10～50μg/次转染，二次纯化）42×HEPES缓冲盐水(HeBS)(pH6.95～7.05)50.0mmol/LHePes;280mmol/LNaCl;10mmol/LKCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/LNaOH调pH至6.95～7.05,过滤除菌后,-20℃保存备用。52.5mol/LCaCl2过滤除菌,-20℃保存备用。6磷酸缓冲盐水（PBS）737℃，5%CO2的加湿培养箱8100mm组织培养平板915ml锥形管[方法与步骤]1传代细胞准备细胞在转染前24ｈ传代,待细胞密度达50%～60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培养液培养细胞。2DNA沉淀液的准备首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于μL无菌水中，加50μL2.5mol/LCaCl2。3用巴斯德吸管在500μL2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。4室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。5将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中，轻轻晃动。6在标准生长条件下培养细胞4～16h。除去培养液，用5ml1×HeBS洗细胞2次，加入10ml完全培养液培养细胞。7收集细胞或分入培养皿中选择培养。[注意事项]1在整个转染过程中都应无菌操作。2为获得最佳实验结果，DNA应不含蛋白质和酚。乙醇沉淀后的DNA应保持无菌，并在无菌水或TrisEDTA中溶解。3沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。4在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都可能导致磷酸钙转染的失败。[参考文献]1Graham,F.L.andVanderEb,A.J.(1973)Virology52,456.2Wigler,M.,Silverstein,S.,Lee,L.S.,Pellicer,A.,Cheng,Y.C.andAxel,R.(1977)Cell11,223.3InvitrogenCorporationCalciumPhosphateTransfectionKitCat.no.K2780-014InvitrogenCorporationCalciumPhosphateTransfectionSystemCat.no.18306-0195InvitrogenCorporation阳离子脂质体转染指南,2003,(1)6颜子颖等译精编分子生物学实验指南北京:科学技术出版社,1998,274-3287晶美实验新知晶美生物工程有限公司8李华等基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较,中国实验动物学杂志,2000,10,(2):65-68xiaoxiangyuyu：我用磷酸钙方法将质粒转染L02、HepG2、3T3、COS细胞，用免疫组化方法鉴定转染结果，只有第一次作出的为阳性结果，后面均为阴性，想请教大家如何提高磷酸钙法的转染效率，转染歨鄹要注意些什么丁香园网友gordon83认为：我觉得做钙转有几点要注意：一是细胞的生长状态，好的培养状态对提高转染效率有很多的左右，我做293T时一般是用接种15~20小时细胞，这时细胞密度为70%左右；二是可以用氯喹处理细胞，这样能提高转染效率，三磷酸钙的颗粒，尽量做的最小，我一般是先把DNA水和氯化钙先加EP管混匀后，将EP管放在Vortex上将转速调到500rpm，然后逐滴加入HBS.加完后迅速均匀加入到dish中，过7~11小时换液.丁香园网友bio_angel认为：推荐使用bbs，因为hbs不好控制