内生真菌混合培养及其抗菌活性的初步研究

内生真菌混合培养及其抗菌活性的初步研究杨民和苏经迁（福建师范大学生命科学学院，福建福州350108）侵染茶树致病的病原微生物主要是病原真菌。目前世界上已记载的茶树病害有500多种我国有138种，其中真菌病害72种，线虫病害9种，寄生性显花植物园16种，其它病原（类菌原体、细菌和类细菌）病害4种，地衣、苔藓25种，藻类24种，非侵染性10种。针对茶树病原菌，目前世界范围内主要使用化学农药来防治，但是化学农药的长期使用带来了许多问题,如昆虫产生抗药性并导致农药使用剂量的不断加大,在粮食、水果、蔬菜中产生残留,由于生物富集作用而使以这些农作物为食物的野生和家养动物的残毒加大。因此,一些国家很早就已经开始研制一系列选择性强、效率高、成本低、不污染环境和对人畜无害的生物农药[1]。生物农药如植物内生菌生产的抗菌剂、抗虫剂及生长素对植物病害起到了很好的防治及促生作用。这样既减少了化学农药对环境的影响、又保证了农产品的品质。所以植物内生真菌的代谢物有的被开发为农作物上用于抗虫的药物的潜力，这可能是更安全、更环保的治疗农作物病虫害的潜在的生物资源库[2]目前，关于茶树内生真菌的研究工件集中在：（1）针对单一菌株的分离、鉴定和培养；（2）侧重单一菌株所产抗菌物质的分离、纯化和结构鉴定。如果把植物内生真菌群理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏在内的病原微生物。如果将单一菌株分离出来进行培养，可能会由于缺乏其它与之相互作用的微生物的刺激作用而使该单一菌株的代谢活性下降，抗菌物质产量降低，甚至无法产生孢子。人类对微生物的利用，经历过天然混台培养到纯种培养两个阶段，分离纯培养技术的发明和应用是微生物学发展的一个巨大进步，但是在长期的实验和生产实践中，人们也不断地发现很多生物过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行，必须依靠两种或两种以上的微生物共同培养完成[3]。研究表明：混合培养时各菌之间可能进直接或间接地相互作用，互相提供所需的营养，转移或消除抑制产物，或通过一些物理或生化机制刺激彼此间的生理活性[4]。随着内生菌纯培养技术的完善和对内生菌间互生和共生现象的研究，进行人工的混合菌培养，力求在人工控制的条件下重现几种内生菌在茶树中的相互关系，进而获取所需的抗菌物质已渐为人们所重视。对混合菌资源的研究不仅具有深远的理论意义，更具有重大的应用价值。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源从采自江西庐山植物园、福建省泉州市安溪县茶园、福建农林大学茶园的茶树上分离到内生真菌。分离方法：取健康茶树的叶、茎和根部先用自来水将新鲜植物组织表面冲洗干净，自然晾干后将茎和根切成1cm左右的小段，用75％酒精漂洗1min，无菌水冲洗3～4次，又用3％次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水冲洗3～4次，每次2min，取最后1次无菌水洗液涂于平板上，在恒温培养箱中28℃培养3～4d，若发现皿中无菌落生成，则证明该材料表面消毒彻底，否则，不能使用。将上述处理过的茶树材料接种到PDA固体培养基置于28℃温箱培养5～7d，待各植物组织切面长出菌丝后挑取边缘部分至试管斜面上，置于28℃温箱继续培养。1.1.2测试用的病原菌的来源2007年4－5月份从福建农林大学茶园采集出现病害症状的茶叶，进行茶树病原菌的分离、鉴定，并获得多毛孢（茶轮斑病）、黑腐菌（茶云纹叶枯病）的纯培养。分离方法：选择典型病斑的茶树叶片，切下病健交界处组织0.5cm×0.5cm的长段（片），将组织块先用70%酒精浸5-6秒，后再用0.1％升汞浸泡１分钟,无菌水洗３次，每次４～５min；组织块在无菌培养皿中适当晾干后，用无菌镊子（在火焰上烧）移到平板培养基上，在28℃恒温下培养．1.1.3培养基PDA培养基（马铃薯琼脂蔗糖培养基）、PD培养基（马铃薯蔗糖培养基）。1.2方法1.2.1实验用菌的选择在内生菌的分离过程中，根据各种菌内PDA平皿上菌落分布及数量，从中筛选出实验用菌，作为混合培养筛选的菌种。1.2.2各菌之间相互关系的初步确定采用两点对峙培养法，对4种菌进行活化后，切取培养6天同质量的内生真菌的菌丝块接种于PDA平板上距中心2cm处同一直线的两点上，同时设接单种菌为对照，每个处理3个重复，于28℃恒温培养，并观察两菌之间的相互关系。同时对能相互混合生长或部分混合生长的用扦片法将盖玻片插入两菌之间的边缘处，并在显微镜下观察，做进一步确认[5～7]。1.2.3发酵过程及发酵液的处理方法由对峙培养法确定的两株木霉以1:1的接种量，用0.5cm的打孔器从平板上各取1块同时接种到发酵培养基摇瓶发酵。三角瓶的装液量为总容积的2/5，即250ml三角瓶中装100ml发酵培养基，摇床转速150r/min，28℃发酵5d，设单独纯种发酵为对照。并观察记录发酵过程中菌种形态与发酵液颜色的变化。发酵完成后，发酵液先经6层沙布过滤后，再用大容量离心机9000r/min离心20分钟，取上清液，然后用滤纸过滤除去未沉淀的菌体，最后用装有2层0.22μm过滤膜的细菌过滤器在无菌的条件下过虑除菌。1.2.4发酵液抗菌活性的测定将5ml发酵液与10ml融化的培养基混匀，倒入无菌培养皿中制成带毒培养基。培养基凝固后，在每个培养基平面放入1块供试菌饼（直径5mm）,使菌饼不带菌丝的一面贴在培养基表面，每个处理3个重复，同时以单一菌株的发酵液和无菌水作为对照。同时以无菌水作为对照，做发酵液的对其它病原菌抑菌实验。培养72～96h后，用十字交叉法测定供试菌菌落生长直径，计算抑制率[8～10]菌丝生长抑制率＝1.2.5不同发酵周期对发酵液抑菌效果影响的实验根据发酵过程中发酵液颜色的变化情况，在相同的培养条件条件下分别取发酵周期为2d、4d、5d、7d的发酵液，经过经6层沙布过滤后，再用大容量离心机9000r/min离心20分钟，取上清液，然后用滤纸过滤除去未沉淀的菌体，最后用装有2层0.22μm过滤膜细菌过滤器在无菌的条件下过虑除菌。然后做对不同发酵时间的发酵液进行抗菌活性的测定。1.2.6不同浓度的发酵液对茶树病原菌孢子的作用效果取供试病原菌的孢子在无菌水与发酵液中配成适当浓度的孢子悬浮液，且两种液体中孢子的浓度应相当，在10×10低倍对照菌落直径－处理菌落直径对照菌落直径－5×100％镜下，每个视野有50～60个孢子。将两种孢子悬液混合配制成含发酵液浓度为0～100％的11个等密度梯度浓度的混合液，各取一滴滴加到凹玻片下，将凹玻片迅速翻转使液滴倒悬在凹玻片下表面，小心将凹玻片放在保温器架上，使液滴倒悬在保湿的小环境中，每个处理3次重复。在28℃的条件下培养8h后检查孢子萌发的情况，同时计算孢子的萌发率。2结果与分析2.1实验用菌的选择结果在内生菌的分离过程中，根据各种菌内PDA平皿上菌落分布及数量，从中筛选出4株菌种，编号为CN1、CN2、CN3、CN4，其中CN1为拟盘多毛孢、CN2、CN3为木霉、CN4为细菌。2.2各菌之间相互关系的初步确定的结果通过两点对峙培养法，两菌之间的关系归纳起来有4种情况[11]：①相互混合；②部分相互混合；③在接触时互相阻止；④在一定距离上互相阻止。其中前3种情况的两株菌均可用于混合培养，尤其是在菌体相互混合的情况下，菌丝体互相交织，相容性较好，更有利于菌体的生长。4株菌在PDA培养基上的具体生长情况见表1。注：菌落相互作用模式：1相互混合；2部分相互混合；3在接触时互相阻止；4在一定距离上互相阻止。由对峙实验的结果可知，CN2CN4能相互混合生长，CN1CN2能部分相互混合生长，通过扦片法在显微镜进一步验证两菌之间的关系（Fig.1,Fig.2）。混合组合观察结果对峙照片CN1CN2CN2CN3CN3CN4两菌关系244134细菌与木霉接触后都停止扩展，接触线清晰明确，与单独培养相比，木霉CN2产生出黄色的物质。两菌落之间相互接近，木霉CN3对细菌形成包围之势，两菌之间有接近2mm的间隔拟盘多毛孢的菌落呈绒毛状，细菌的菌落紧密环绕在周围，形成对峙，两菌之间有接近3mm的间隔两菌生长都较快，由于CN3产生的孢子易扩散到其他角落，且能在长有CN2的平皿上生长，与CN3接触的CN2都有产生大量的黄色物质拟盘多毛孢的菌落呈绒毛状，木霉CN2的菌落紧密环绕在周围，形成对峙，两菌之间无明显交错生长现象。木霉CN3逐渐包围拟盘多毛孢，且两菌之间有接近4mm的间隔。CN1CN3CN2CN4CN1CN4由于CN2CN3相互混合生长，且与单独纯培养相比，CN2产生大量的黄色的物质，所以选定CN2CN3作为混合发酵的菌种，进一步验证其发酵液的抑菌效果。2.3发酵过程中混合发酵与纯种发酵菌种形态与发酵液颜色的变化情况不同的菌株之间由于生长周期及营养要求的不同，使各菌种在相同的培养条件下，反映出不同的现象，混合培养时菌种之间产生的胞外分泌物充当了一种信息化学物质的作用[12]，能刺激产生单独培养是无法产生的代谢物质。当CN2与CN3混合发酵时，以两菌单独培养做为对照，每隔24小时观察一次，具体情况见表2Fig.2CN1CN2两菌混合培养显微照片Fig.1CN2CN4两菌混合培养显微照片发酵时间(h)观察结果CN2CN2CN3CN324，发酵液淡黄色，液体呈粘稠状，球状菌数量增加，但个体体积缩小球状菌体数量增加，发酵液变成淡黄色发酵液呈灰白色，菌体浓度增加，发酵液变稠发酵液呈黄绿色，内清晰可见有大球状菌体。有大量的白色球状菌体生成，体积比24h时大。迅速繁殖，同时有大量的灰白色菌丝体发酵液呈灰白色，有大量的菌丝体产生，内少量的球状菌体发酵液内吸人少量的球状菌体生成发酵液呈灰色，少量菌体发生自溶96发酵液呈黄褐色，静置时发酵液与菌体能明显分层。球状菌体呈褐色，发酵液中有少量的丝状体生成。7248发酵液呈黄色，菌丝体短而多，球状菌数量减少。球状菌体体积缩小，数量增加有的菌体发生结团，发酵液中菌丝体含量明显减少大量菌体发生自溶，发酵液稠度增加发酵到120h与发酵96h的混合培养与单独培养的比较图片如图3，4（Fig.3,Fig.4）2.4发酵液对病原菌的抑制作用从表3可以看出在带有CN2CN3混合培养的发酵液的培养皿中茶花病菌的直径只有2.81cm，与对照组6.15cm相比，对茶花病菌的抑制率在60％左右，而在带有CN2单独培养发酵液的培养120CN2CN2CN3CN3Fig.4发酵120h时混合与单独培养比较CN2CN2CN3CN3Fig.3发酵96h时混合与单独培养比较皿中茶花病菌的直径高达6.47cm见图5（Fig.5），这说明当CN2单独培养时不但不产生抑制茶花病菌的物质，而CN2本身在没有CN3存在的条件下却能产生促进茶花病菌的物质。试验结果表明CN2CN3混合培养的发酵液对茶花病菌有较强的抑制能力，且混合培养能产生单独培养所不能产生的物质。Fig.4带发酵液的培养皿中茶花病菌的直径1.混合培养发酵液对茶花病菌生长生长的作用效果2.CN3单独培养时对茶花病菌生长生长的作用效果3.CN2单独培养时对茶花病菌生长生长的作用效果4.加无菌水的对照表3含不同发酵液的平皿中茶花病原菌菌落的直径01234567混合培养木霉绿霉无菌水不同发酵液的平皿病原菌的直径大小(cm)方差0.04方差0.05方差0.17方差0.12表4CN2CN3混合培养的发酵液的抗菌谱实验情况在含发酵液的培养在含无菌水的培养抑菌率(%)病原菌基中的直径(cm)基中的直径(cm)稻瘟菌1.054.3185.60茶花病原菌2.816.1559.12茶云纹叶枯病2.374.9057.50茶轮斑3.928.1855.402.5不同发酵周期的发酵液抑菌效果影响同样以茶花病原菌为指示菌，研究不同发酵周期对CN2CN3混合培养的发酵液抑菌活性的影响影响。取混合发酵液颜色发生变化时为取样点。结果见表4（以无菌的液体PDA培养基的抑菌效果为0,其它的时间下处理后的抑菌效果与其相比较所得的百分比为相对抑制效果）。在发酵周期为5d（120h）时，混合培养发酵液对茶花病原菌的抑制效果相对较强（70.6%），但随着发酵周期的延长，发