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实验报告乙酰苯肼制作小鼠血虚证模型及中药疗效观察——小鼠造模、四诊观测及病理部分**********血虚证是临床常见的疾病证型之一。血虚证动物模型是探讨该证的实质、研究其病理机制和防治措施的中药途径。本实验选取了造模方简便、结果可靠的乙酰苯肼制作血虚证模型，并用传统血虚证治疗方剂四物汤与当归补血汤进行治疗，分析、比较治疗效果的异同。一、材料及方法（一）实验材料1.实验动物造模用清洁级雄性ICR小鼠43只，体重26±3g。饲养于内铺垫料的塑料笼，每天自食普通颗粒饲料。2.仪器及设备SQF-EA体式显微镜；NIKONCoopix4500数码相机；自制光源设备；数字WMY-01型温度计；MP200B型电子天平；YLS-13A大小鼠抓力测量仪；相机三脚架，划有小方格的透明薄膜纸及改造的小鼠移动笼具等；一次性注射器等；眼科剪：直无勾10cm、弯无勾10cm各5把；组织镊：12.5cm2把；眼科剪：直尖10cm4把；解剖剪：cr/4，4把；普通双面刀片：10片/盒×1盒；染色架：5个；染色缸：1000ml，14-15个；切片盒：50片/盒×3盒或100片/盒×2盒；玻璃漏斗：φ903个；玻璃搅棒2支；普通粗孔大张滤纸：20张；Φ90mm玻璃培养皿4个；中号普通毛笔2支；烧杯：500ml、1000ml各1个；量筒：100ml、500ml、1000ml各1个；组织切片机及配套刀片：2台；摊片用水浴锅：2台；生物切片石蜡：5盒，熔点：56-58℃；37°、60°恒温箱：各1个；磨砂载玻片：50片/盒×3盒；盖玻片：100片/盒×2盒；广口瓶：30ml或60ml×20个；滴管及配套吸头：4个；酒精灯：150ml4台；脱水篮：1-2个；打火机、标签纸、铅笔各一，卷筒纸，乳胶手套、口罩足量。3.药物及试剂乙酰苯肼溶液（APH，CP，白色粉末状固体，临用时配制成2%溶液）；0.9%氯化钠溶液500ml*1瓶；苦味酸（2.4.6-三硝基苯酚）：30g/瓶×1瓶；37%-40%福尔马林液：500ml/瓶×1瓶；无水乙醇：AR，500ml/瓶×1瓶；二甲苯:AR，500ml/瓶×1瓶；Hematoxylin苏木素（苏木精）：10g/瓶×1瓶；酸性品红（曙红丫水溶）：25g/瓶×1瓶；碘酸钠：AR，500g/瓶×1瓶；柠檬酸：AR，500g/瓶×1瓶；水合氯醛：250g/瓶×1瓶蛋白甘油（甘油/鸡蛋清=1/1）：50ml；中性树胶：100g/瓶×2瓶；蒸馏水：500ml（二）实验方法1.动物分组43只ICR小鼠按体重随机分层，分为正常组、模型组、当归补血汤组、四物汤组，除正常组为10只外，其余三组均为11只。2.造模及给药表1造模及给药组别造模及给药正常组第1、5天皮下注射与造模等量的生理盐水；第1-7天每天1次灌胃自来水0.5ml/只模型组皮下注射2%乙酰苯肼溶液，第1天剂量为0.09ml/10g，第5天剂量为0.05ml/10g，共2次；同时第1-7天每天1次灌胃自来水0.5ml/只当归补血汤组造模同模型组；第1-7天每天1次灌胃相应中药水煎液0.5ml/只四物汤组造模同模型组；第1-7天每天1次灌胃相应中药水煎液0.5ml/只3.饮水、饮食量自造模之日起，各组动物添加等量的水及饲料，水：500ml/组；饲料：380g/组。4.检测指标（1）动物一般情况：主要包括动物死亡情况，动物外观分析，饮水摄食情况等。（2）四诊计量化指标1)第1、8天各检测1次，共2次。指标包括体重、腋温、爪尾显微拍照、抓力、旷场等。2)四诊数据处理:①用Excel表格建立原始检测数据库，不同日期的检测插入新表，形成完整证候演变档案。每张表的“行”为不同组别、各动物及其编号，“列”为各检测内容，及实测值和换算值。包括：体重、抓力、腋温、爪r、尾r、水平、直立等。②求出正常对照组各指标均数。③求出各组小鼠实测值与正常对照组均数的比值，以及各证候程度的值。④计算③中求出的那些值的各组均数以及标准差，作图并分析，标明有无统计意义。⑤汇总不同日期检测的各组小鼠数据，用以观察证候的发展和演变。3)证候的计算公式及辨证气盛衰度=各动物水平移动实测值/正常组组均值×0.3+各动物直立次数/正常组均值×0.2+各动物抓力实测值/正常组均数×0.5；辨证标准：与正常组比较，＞1.5为气盛，＜0.75为气虚，＜0.5为气虚甚，＜0.25为气亏。阳盛衰度=各动物腋温/正常组组均值×0.3+各动物爪r/正常组均值×0.5+各动物尾r/正常组均值×0.2；辨证标准：与正常组比较，＞1.02为阳气盛，＜0.98阳虚，＜0.95阳虚重，＜0.9阳损。阴盛衰度=各动物体重/正常组均值；辨证标准：与正常组比较，＞1.2为形丰，＜0.85为阴虚，＜0.7为阴亏，＜0.6为液脱。血盛衰度=各动物爪r/正常组均值×0.6+各动物尾r/正常组均值×0.4；辨证标准：与正常组比较，＞1.1为血充盈，＜0.9为血虚，＜0.8为血虚重，＜0.7为血亏。（3）病理切片制作及读片第8天处死小鼠，取脾脏和十二指肠固定，常规方法制作病理切片，主要负责脾脏和肠的读片。病理组织切片的制作：a.固定液、染色液的配置；b.组织取材：取肝、脾、胃和十二指肠等脏器；c.固定与修块；d.脱水和透明；e.浸蜡、包埋与修蜡块；f.切片；g.脱蜡、染色与脱水；h.封片。5.统计方法计量四诊指标以平均值±标准差表示，组间比较采用SPSS统计软件进行单因素方差分析（ANOVE），组间比较采用LSD法得出P值，检验标准p=0.05。二、实验结果（一）动物死亡情况实验过程中，共死亡小鼠21只，正常组死亡1只，模型组死亡7只，当归补血汤组死亡7只，四物汤组死亡6只。（二）动物全身状态外观1.正常组。实验第5日，小鼠仍然较为活跃2.模型组。实验第5日，小鼠出现少动、扎堆，欠活跃，爪、尾凉。3.当归补血汤组。实验第5日，小鼠出现少动、扎堆，眯眼，被毛疏松，爪、尾凉。4.四物汤组。实验第5日，小鼠出现少动、扎堆，眯眼，被毛疏松，爪、尾凉。（三）饮水、摄食情况图1饮水情况图2摄食情况由图1、2可知，正常组的饮水和摄食量均高于其他三组，当归补血汤组、四物汤和模型组相差不大。（四）四诊检测1.气盛衰度图3抓力比较图图4垂直运动比较图5图5水平运动比较图图6气盛衰度由图3、4、5、6可知（1）抓力比较：正常组、模型组、治疗I组、治疗II组的抓力，造模前、后各组间无显著差异(P＞0.05)（2）垂直运动比较：正常组垂直运动明显下降，模型组垂直运动无明显变化，治疗I组垂直运动明显上升，治疗II组垂直运动下降，与正常组相比，模型组、治疗I组有显著性差异（P0.05）（3）水平运动比较：正常组水平运动明显下降，模型组水平运动略有上升，治疗I组水平运动明显上升，治疗II组水平运功略有下降。与正常组相比，模型组、治疗I组比较有显著性差异（P0.05）（4）气盛程度比较：正常组气盛衰度无明显变化，模型组、治疗II组略有上升，治疗I组则明显上升。与正常组相比，模型组、治疗I组有显著差异(P0.05)2.血盛衰度图7各组爪r比较图图8各组尾r比较图图9血盛衰度由图7、8、9可知（1）小鼠爪r比较：造模前、后各组间无显著差异(P＞0.05)（2）小鼠尾r比较：与正常组相比，模型组有显著性差异(P0.05)，两组治疗组无显著性差异(P＞0.05)（3）血盛衰度比较：正常组的血盛衰度变化不大，模型组、治疗I组、治疗II组的血虚程度均有加重，治疗I组、治疗II组尤其明显，造模前、后四组间比较血虚程度均无显著性差异(P＞0.05)3.阴盛衰度图10各组体重比较图由图10可知，第1日，四组小鼠体重基本相同，第5日模型组、治疗I组、治疗II组体重均比第1日减轻，正常组略有增加，第8日正常组、模型组、治疗II组体重无明显差别，但治疗I组体重明显增加。与正常组相比，三组均无显著差异（P0.05）图11各组阴盛衰度比较图由图11可知，正常组、模型组、治疗II组无明显变化，治疗I组明显阴盛。与正常组相比，模型组、治疗II组无显著性差异(P＞0.05)，治疗I组有显著性差异（P0.05）5.阳盛衰度图12各组腋温比较图由图12可知，四组腋温均有下降，模型组最为明显。与正常组相比，模型组有显著性差异(P0.05)，两个治疗组无显著性差异(P0.05)图13阳盛衰度由图13可知，正常组、治疗I组无明显变化，模型组和治疗II组明显下降。与正常组相比，模型组有显著性差异（P0.05），两组治疗组均无显著性差异(P＞0.05)6.同病异证（1）同样的处理，组内不同个体出现不同的证候如第8天模型组，6号无证可辨，8号为气盛证图14同一个体不同证候由图14可知，同一组别中的不同小鼠，其辨证结果也是不同的。（2）同一个体，存在证候的演变如由第1天数据、第8条数据可知，治疗II组1号小鼠明显向气盛证候方向演变图15同一个体证候演变由图15可知，小鼠也会发生证候的演变（五）病理读片结果1.脾图16正常组脾脏（400倍）图17模型组脾脏（400倍）图18当归补血汤组脾脏（400倍）图19四物汤组脾脏（400倍）由图17可知，正常组边界清晰，常组脾脏白髓与红髓；由图17可知，模型组脾脏上分布着大量含铁血黄素，白髓、红髓边界不清，互相融合，呈现溶血性贫血脾脏病理表现，可见乙酰苯肼造模成功；由图18可知，治疗I组(当归补血汤组)脾脏上分布大量含铁血黄素，白髓、红髓互相融合；由图19可知，治疗II组(四物汤组)脾脏上分布大量含铁血黄素，白髓、红髓边界不清。2.十二指肠图20正常组十二指肠（400倍）图21模型组十二指肠（400倍）治疗1组图22当归补血汤十二指肠（400倍）图23四物汤十二指肠（400倍）由图20可知，正常组十二指肠肠绒毛排列整齐，可见内陷的肠腺由图21可知，模型组肠腺数量较少由图22可知，治疗I组(当归补血汤组)肠腺数量减少由图23可知，治疗II组(四物汤组)肠腺数量较少。三、讨论1.关于乙酰苯肼造模问题从本次实验来看，造模是成功的。第一组从动物外观上看到，造模第5天，即出现爪部颜色变白、眼睛颜色变淡、被毛疏松等改变，本组观测到模型组脾脏病理切片显示，脾脏上有大量含铁血黄素分布，并且白髓与红髓互相融合，边界不清。第三小组观测到模型组肝脏病理切片显示，肝脏上也有大量含铁血黄素分布；第二组的实验室检查中亦发现外周血中红细胞大小不等，伴有红细胞碎片。三组结果显示，此次实验血虚证模型造模成功。2.关于小鼠证候问题证候动物模型是否表达了人体证候的表现特征，这是非常重要的，仅仅以局部的病理损伤、实验指标水平作为模型建立的评价标准，这与中医理论中人体证候的整体、动态、表征等特征相去甚远。本次实验观察了小鼠的体重、腋温、爪尾显微观察、抓力、旷场等四诊指标，实验方法较为客观，可以整体显示小鼠在整个实验过程中证候变化。在本次实验四诊观察结果中，从血盛衰度变化可以看出，除了正常组小鼠变化不大外，其余三组均发生了不同程度的血虚，都有血虚证，以治疗I组与II组最为明显；从气盛衰度来看，除了正常组小鼠变化不大外，其余三组均发生了不同程度的气盛，治疗I组最明显；从阴盛衰度来看，治疗I组发生了显著上升，说明治疗I组有阴盛证候的演变；从阳盛衰度来看，模型组，治疗II组发生了显著下降，说明这两组有阳虚证候。可见，模型组，治疗I组，治疗II组小鼠除了有血虚证外，还伴有其他证候，此次实验所造的是一个综合性的复合证，并非单一的血虚证。而且，我们发现，造模后，小鼠都出现了腋温降低的现象，伴有明显的阳虚证，在实验观察时，我们发现小鼠也有同病异证的情况。采用相同的方法造模，之后同样处理，不同的小鼠其证型也会不同，这就提示我们小鼠也有个体化差异，辨证论治在小鼠身上也是可行的。3.当归补血汤、四物汤疗效问题当归补血汤、四物汤是临床治疗血虚的常用方，此次实验中到底哪个方子的疗效更好呢？首先，从第一组得到的结果可以看出，四物汤在改善血盛衰度方面较当归补血汤疗效好，且从脾脏病理切片来看，四物汤效果好，但是在改善气盛衰度、阴盛衰度、阳盛衰度方面，当归补血汤效