荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践(RealtimeQuantitativePCR)北京康为世纪生物科技有限公司RealtimeQuantitativePCR2北京康为世纪生物科技有限公司康为的目标：成为中国的Invitrogen您的问题解决专家！3北京康为世纪生物科技有限公司分子生物学核酸提取PCR、RT-PCR及荧光定量PCRDNA分子量标准克隆与转化蛋白质学相关蛋白提取与纯化蛋白定量、蛋白Marker及蛋白电泳产品WesternBlot产品免疫学相关免疫组化产品、免疫沉淀标签抗体内参抗体二抗完善的产品线4五大平台一站式服务5园区公共服务平台2010年康为世纪公司依托江苏省泰州市政府及中国医药城的支持政策，成立江苏康为世纪，主要进行创新的临床诊断试剂的研发、生产与相应的技术服务，占地面积约3300平米2700平米的实验区:临床生化诊断试剂研发平台免疫诊断试剂研发平台分子诊断试剂研发平台免疫组化诊断试剂研发平台约300平米GMP标准的生产车间总投资6500万元泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台6荧光定量PCR仪芯片点样仪芯片扫描仪全自动核酸提取仪超速离心机焦磷酸DNA测序仪分子生物学平台凝胶成像仪泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台芯片杂交仪康为世纪生物科技有限公司7完善的产品线分子生物学全系列产品蛋白质学产品免疫学相关产品一站式服务平台实验设计平台分子生物学平台蛋白表达与纯化平台抗体制备纯化平台免疫学检测平台北京康为世纪生物科技有限公司我们的客户我们的合作伙伴北京大学、清华大学、复旦大学等中国科学院协和医院、上海瑞金、军事医学科学院301医院、医院华大基因、诺华制药九强、博奥等用我们的产品发表的部分SCI文章a-Bisabololinducesdose-andtime-dependentapoptosisinHepG2cellsviaaFas-andmitochondrial-relatedpathway,involvesp53andNFkBStateKeyLaboratoryofVirology,CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,ChinaCCR4-NOTDeadenylatesmRNAAssociatedwithRNA-InducedSilencingComplexesinHumanCellsStateKeyLaboratoryofMolecularBiologyandCellBiology,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai,ChinaCoadministrationofhuperzineAandligustrazinephosphateeffectivelyreversesscopolamine-inducedamnesiainratsSchoolofPharmacy,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,PRChinaEffectsofMicrogravityModeledbyLargeGradientHighMagneticFieldontheOsteogenicInitiationofHumanMesenchymalStemCellsCCR4-NOTdeadenylatesRISC-associatedmRNAinhumancellsStateKeyLaboratoryofMolecularBiology,InstituteofBiochemistryandCellBiologyShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofScienceshanghai,china主要内容CompanynameReal-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的检测方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4PCR：伟大的天才发明•UseofLSD•Synthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstances•BeliefinastrologyCYCLENUMBERAMOUNTOFDNA01122438416532664712882569512101,024112,048124,096138,1921416,3841532,7681665,53617131,07218262,14419524,288201,048,576212,097,152224,194,304238,388,6082416,777,2162533,554,4322667,108,86427134,217,72828268,435,45629536,870,912301,073,741,824311,400,000,000321,500,000,000331,550,000,000341,580,000,000PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：•Template•Primers•DNApolymerase•dNTP,N=A,G,CorTPCR：基本原理Companyname•理想的PCR反应：N=N0*2n•实际的PCR反应：N=N0*(1+E)n•N0：初始模板量•N：第n次循环后的产物量•n：扩增反应的循环次数E：扩增效率S形曲线，具有平台效应Companyname与普通PCR的对比同一个样本进行96次重复传统PCR检测RealtimePCR检测RealtimePCR--起点检测：--起点量是样本中起始的DNA量--“加入了500个拷贝”--具有重现性，误差小传统PCR--终点检测：--终点产物量经过PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000个拷贝”--不恒定，误差大传统PCR检测Real-timeqPCR激发光发射光--在PCR反应体系中加入荧光基团。--荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。--利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。荧光基团扩增曲线（primarycurve）Companyname扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：Rn（荧光值）横坐标：cyclenumber（循环数）线性图对数图Companyname荧光阈值（threshold）基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值--缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍--手动设置：大于样本的荧光背景值Ct值(CycleThreshold)值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。起始模板量基线阈值Ct值Ct值(CycleThreshold)值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性Ct值可以确定初始模板量？Rn=RB+X0(1+E)N*RS第n个循环的总信号=本底信号+起始DNA数目*PCR扩增效率*单位信号强度当循环次数n=Ct时RCt=RB+X0(1+E)Ct*RS两边同时取对数得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)Ct=-klgX0+bCompanynamelgX0与Ct值呈线性关系根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数起始拷贝数越多，Ct值越小。CompanynameRnvs.Cyclenumber--扩增曲线LogDNAvs.Ct--标准曲线.未知10410310610510210标准曲线(standardcurve)标准曲线分析--对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释y=-ax+b测定荧光定量PCR反应的有效性--线性的标准曲线：相关系数R2--扩增效率：扩增效率(E)=10-1/斜率-1标准曲线分析荧光定量PCR检测方法Companyname染料标记：SYBRGreenI探针标记：水解探针：TaqMan非水解探针：MolecularbeaconCompanynameSYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBRGreenI只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。荧光信号强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--变性时，DNA双链分开，无荧光信号。--延伸结束时，采集荧光信号。SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI优点：使用方便，成本低--仅需设计两个引物通用性好--对DNA模板没有选择性需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。缺点：SYBRGreen与所有双链DNA结合--引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性--只能检测单一模板，无法进行多重检测Companyname将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线(dissociationcurve)确认PCR反应产物的特异性对数图谱原始图谱融解曲线分析--非特异性产物--引物二聚体Taqman工作原理探针与靶序列配对（一段序列，两个基团，5’报告基团、3’淬灭基团）完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭，没有荧光产生。聚合酶的5’外切酶活性报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。Taqman工作原理在退火过程中，探针与靶序列结合探针被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离SYBRGreenI与Taqman对比Taqman特异性高--与特异靶序列结合对模板有选择性--可进行多重PCR反应SYBRGreenI使用方便，成本低--仅需设计两个引物通用性好--对DNA模板没有选择性荧光定量PCR解析方法绝对定量样本中核酸的量（拷贝数、微克）--检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有6000个拷贝相对定量不同样本中目的基因表达量的差异--肿瘤组织和正常组织相比某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变了60倍绝对定量Sample--样本起始浓度与Ct呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。--根据未知样品的Ct值，推算出未知样本量。以标准品为标杆绝对定量的步骤拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量PCR反应建立标准品未知样品Ct代入标准曲线确定拷贝数质粒提取OD值测定计算待测样本浓度/样本分子量/待测样本拷贝数标准品进行5-6个梯度稀释标准品稀释倍数为10相对定量参照样本Calibrator用于比较结果的基准。35相对定量特点选择内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因housekeepinggene在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小--文献检索--实验筛选内参基因--同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。--RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。2-ΔΔCt法Co