分光光度法基本原理简介

11分光光度法基本原理简介分光光度法基本原理简介分光光度法（spectrophotometry）是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为紫外分光光度法、可见分光光度法及红外分光光度法。特点：灵敏度较高，适用于微量组分(1~10g·L-1)的测定；误差较大，相对误差达到2~5%。22电磁波谱：X射线0.1~100nm远紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可见光400~760nm近红外光750~2500nm中红外光2500~5000nm远红外光5000~10000nm微波0.1~100cm无线电波1~1000m1.物质的颜色与吸收光的关系日光：紫蓝青绿黄橙红2014-11-32014-11-333复合光：由各种单色光组成的光。如白光(太阳光)单色光：只具有一种波长的光。要求：=2nm。互补色光：如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。如：CuSO4呈兰色。物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。光的互补：蓝黄日光2014-11-32014-11-344日光红黄青绿蓝紫青蓝橙650~760nm580~600nm450~480nm480~490nm600~650nm500~580nm400~450nm490~500nm互补光2014-11-32014-11-35522..物质的吸收曲线物质的吸收曲线M+热M+荧光或磷光E=E2-E1=h各能级是量子化；选择性吸收;分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；M+hM*基态激发态E1（△E）E266用不同波长的单色光照射，测定吸光度，如果以波长为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为吸收曲线（~A曲线）。吸收曲线清楚地描述了物质对光的吸收情况。吸收曲线00.10.20.30.40.50.6400450500550600650波长（nm）Amax=510nm77（1）不同物质不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同。MnO4-531吸收曲线2014-11-32014-11-388（2）同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似。吸收曲线是特性的，可以提供物质的结构信息，作为物质定定性性分析的依据之一；吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。9933..光的吸收定律光的吸收定律————朗伯朗伯--比耳定律比耳定律吸光度A：物质对光的吸收程度。定义：A＝lg（I0/It)A越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。10101760年朗伯(Lambert)阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：A∝b•1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：A∝c二者的结合称为朗伯—比耳定律，A∝bc1111朗伯朗伯——比耳定律数学表达式：比耳定律数学表达式：A＝lg（I0/It)=εbc式中：A，吸光度，无量刚；b，液层厚度(光程长度)，cm；c，溶液的浓度，mol·L-1；ε称为摩尔吸光系数，L·mol-１·cm-1，仅与入射光波长、溶液的性质及温度有关，与浓度无关。上式表明：当一束单色光通过溶液时，其吸光度与溶液浓度和宽度的乘积成正比。1212TT、、AA、、cc间的关系：间的关系：AA＝＝lglg（（II00//IItt))=-=-lglgTT==εεbcbc透光度(透光率)T：透过光和入射光强度之比，即T=It/I0×100%T越大，表示对光的吸收越小。1313吸光度具有吸光度具有加和性：加和性：在多组分体系中，吸光度具有加和性，即：在多组分体系中，吸光度具有加和性，即：AA（总）＝（总）＝AA11++AA22++……++AAnn==εε11bc+bc+εε22bc+bc+……++εεnnbcbc1414其方法和步骤是：其方法和步骤是：11）配制一组浓度不同的标准溶液）配制一组浓度不同的标准溶液((cc11、、cc22…………))；；22）在一定波长下，分别测定其吸光度）在一定波长下，分别测定其吸光度((AA11、、AA22…………))。。33）以）以AA为纵坐标，浓度为纵坐标，浓度cc为横坐标，绘制曲线，得到一条通过为横坐标，绘制曲线，得到一条通过原点的直线，称为原点的直线，称为标准曲线标准曲线（（A-cA-c曲线）。曲线）。44）用完全相同的方法和步骤测定待测溶液的吸光度）用完全相同的方法和步骤测定待测溶液的吸光度AAxx，从标，从标准曲线上找出对应的浓度准曲线上找出对应的浓度ccxx值（值（AAxxccxx）。）。4.定量测定方法——标准曲线法151500.20.40.60.800.20.40.60.81c(mmol/L)AAxcx空白标准溶液待测溶液BlankStandardSampleSamplec1c2c3c4cxc0标准曲线标准曲线16165.5.配合物配位比的测定配合物配位比的测定物质的量比法物质的量比法：：固定一种组分如金属离子固定一种组分如金属离子MM的浓度，改的浓度，改变配位剂变配位剂RR（显色剂）的浓度，得到一系列比值不同的溶液，（显色剂）的浓度，得到一系列比值不同的溶液，并以相应的试剂空白作参比溶液，分别测定其并以相应的试剂空白作参比溶液，分别测定其AA。以。以AA为纵坐为纵坐标，配位剂与金属离子的浓度比值为横坐标作图。当配位剂减标，配位剂与金属离子的浓度比值为横坐标作图。当配位剂减少时，金属离子没有完全被配合。随着配位剂的增加，生成的少时，金属离子没有完全被配合。随着配位剂的增加，生成的配合物便不断增多。当金属离子全部被配位剂配合后，再增加配合物便不断增多。当金属离子全部被配位剂配合后，再增加配位剂，其吸光度亦不会增加了。图中的转折点不敏锐，这是配位剂，其吸光度亦不会增加了。图中的转折点不敏锐，这是由于配合物解离造成的。利用外推法可得一交叉点由于配合物解离造成的。利用外推法可得一交叉点DD，，DD点所对点所对应的浓度比值就是配合物的配合比。应的浓度比值就是配合物的配合比。1717ACR/CMD物质的量比法外推法得一交点D，D点对应的浓度比值就是配合物的配合比。参见《无机及分析化学》P373页A最大aa..目视比色法目视比色法用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方法称为目视比色法。法称为目视比色法。特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不高。高。bb..分光光度计分光光度计66..紫外紫外——可见分光光度计可见分光光度计2014-11-32014-11-31919仪器基本组成仪器基本组成光源单色器样品室检测器显示器a.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。2014-11-32014-11-32020b.b.单色器单色器又称波长控制器，其作用是将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出一任波长单色光的光学系统。包括狭缝、色散元件和准光装置。色散元件的作用是将复合光分解成单色光，有棱镜或光栅两种。2121c.c.样品室样品室样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。e.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理d.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。11))显色反应显色反应22))显色反应条件的选择显色反应条件的选择33))测量条件的选择测量条件的选择77..显色与测量条件的选择显色与测量条件的选择11）显色反应）显色反应显色反应显色反应————使无色或浅色的待测组分转变为有色化合物的使无色或浅色的待测组分转变为有色化合物的反应。反应。显色剂显色剂————可与待测组分反应形成有色化合物。可与待测组分反应形成有色化合物。FeFe2+2++3R+3R[Fe(3R)][Fe(3R)]2+2+　（红橙色，　（红橙色，maxmax=510nm=510nm））RR为邻二氮菲为邻二氮菲NN242422））显色反应条件的选择显色反应条件的选择a.显色剂用量——选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）的显色剂用量。b.反应体系的酸度——选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）所对应的pH范围。c.显色时间与温度d.溶剂一般尽量采用水相测定。252533）测定条件的选择）测定条件的选择a.选择适当的入射波长一般选max为入射光波长。如果max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。2626b.b.选择合适的参比溶液选择合适的参比溶液•为什么需要使用参比溶液？使测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。A=A1+A2+…+A(x)，A1+A2+…=0,A=A(x)。参比溶液的选择一般遵循以下原则：⑴若仅待测组分与显色剂反应产物有吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；⑵若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；⑶若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；2727c.c.控制适宜的吸光度（读数范围）控制适宜的吸光度（读数范围）用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T=15～65%，相应地吸光度A=0.80～0.20。当溶液的吸光度或透光率不在此范围时，可以通过改变溶液浓度及选择不同厚度的比色皿来控制。2828实验实验分光光度法测定铁的含量分光光度法测定铁的含量一、实验目的一、实验目的1.1.了解分光光度法测铁的基本原理；了解分光光度法测铁的基本原理；22..学习分光光度法中显色与测量条件的优化与选择；学习分光光度法中显色与测量条件的优化与选择；33..学习标准曲线的绘制以及试样测定方法；学习标准曲线的绘制以及试样测定方法；44..了解分光光度计的性能、结构及使用方法。了解分光光度计的性能、结构及使用方法。2929二、实验原理二、实验原理A=A=bcbc在一定实验条件下，在一定实验条件下，AA==kckc，，AAxx值值ccxx值。值。pH3~9pH3~9，，FeFe2+2+与与PhenPhen反应：反应：FeFe2+2++3R+3R[Fe(3R)][Fe(3R)]2+2+　（红橙色，　（红橙色，maxmax=508nm=508nm））（注：（注：FeFe3+3++3R+3R[Fe(3R)][Fe(3R)]3+3+，兰色，，兰色，maxmax=600nm=600nm））用盐酸羟胺还原，再显色反应，则可以测得溶液中总铁含量：用盐酸羟胺还原，再显色反应，则可以测得溶液中总铁含量：22FeFe3+3++2NH+2NH22OHOH··HCl=2FeHCl=2Fe2+2++N+N22+2H+2H22O+2ClO+2Cl--不用盐酸羟胺还原，测定出的为亚铁的含量。不用盐酸羟胺还原，测定出的为亚铁的含量。3030三、实验步骤三、实验步骤11..吸收曲线的制作吸收曲线的制作试剂溶液：不加铁标，其余同上配制。稀至刻度100mg/L铁标10%盐酸羟胺50摇匀0.15%邻二氮菲1mol/LNaACH2O试样溶液：1.00mL1.00mL2.00mL5.00mL3131三、实验步骤三、实验步骤（二）吸收曲线的绘制（二）吸收曲线的绘制吸收曲线的绘制吸收曲线的绘制((补充补充))——选择测定铁的最佳波长；选择测定铁的最佳波长；在分光光度计上，用在分光光度计上，用1cm1cm的比色皿，在的比色皿，在440-560nm440-560nm间，每隔间，每隔10nm10nm测定一次测定一次55号试液的吸光度。以波长号试液的吸光度。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出吸收曲线。为横坐标，吸光度