链霉菌总DNA提取

1.链霉菌总DNA提取讲义1。1菌丝体用YEME、TSB、TSBY培养，蔗糖浓度：34%SCO,Slividans，分散菌丝体;10%其他菌种，有的不适于在高糖条件下生长。是否污染：闻气味；看清汤。1。2DNA提取总DNAStr总DNAStr质粒Ecoli溶菌-细胞壁需溶菌酶，作用时间可长可短需溶菌酶，作用时间可长可短不需溶菌酶处理破坏原生质体SDS(无NaOH)03MNaOH，2%SDS02MNaOH，1%SDS去除蛋白苯酚/中苯酚/酸性苯酚沉淀DNA盐乙醇（2X）异丙醇（1X）NaOH使线形DNA变性苯酚不能除去多糖，使上清不澄清，此时可用盐析法除多糖和蛋白质。注意：菌丝体用量不能多。SDS量：2%SDS与溶菌酶溶液等体积。乙醇（2X）沉淀：特异性优于异丙醇，然而体积大。-20C，1hs,或4C，O/N，时间越长越好，可用于长距离携带。异丙醇沉淀时间：=10MIN,roomtemperature,不能置于4C，-20CA溶菌：菌丝体用量不能多！需溶菌酶，作用时间可长可短，溶菌完全即可，但不能O/N溶菌酶溶液用缓冲液配，高渗或等渗：原生质体同步裂解，在不需要时不裂解。菌丝体培养基中加入甘氨酸，使肽聚糖骨架变松，对溶菌酶更敏感。BCDEFGHIJSDS法2.9.1链霉菌总DNA少量快速提取收集链霉菌菌丝体并用10.3%蔗糖洗涤1次，将100ul菌丝体在eppendorf离心管中用TE洗涤1次,于菌体沉淀块中加入500ul溶菌酶溶液,用自动移液器吸管头快速、强烈抽吸以悬浮和裂解细胞直到溶液变粘稠。加入50ul20%SDS,（或100ul10%SDS）混匀,37℃保温10分钟后,加入0.5倍体积的中性苯酚/氯仿,混匀后离心,向上清液加入0.1倍体积NaAC(pH4.8)和等体积异丙醇,颠倒混匀,将白色絮状沉淀挑出到70%乙醇中洗涤,离心,DNA沉淀块再分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤后溶解在适量TE缓冲液中。2.9.2大片段链霉菌总DNA提取(用于构建基因文库)适量的菌丝体(50ml液体培养物),溶于10ml含2mg/ml溶菌酶的LRTE溶液(2mg/ml溶菌酶,25mMTris-HClpH8.0),100mMEDTA(pH8.07,RNase50ug/ml)中,37℃溶菌至溶液清澈透亮。加入蛋白酶E至终浓度为0.2mg/ml,小心轻轻混匀,30℃,30分钟,加入20%SDS至终浓度为1%,立即轻轻倾斜混匀,37℃水浴2小时。冷却至室温,加入等体积中性苯酚,轻轻混匀(约需10分钟),使液体均一相形成乳浊液,5000g离心15分钟,用大口径移液管转移上清液,根据中间蛋白质的多少,重复使用中性苯酚抽提。经中性苯酚抽提了的上清液,再用氯仿抽提两次。最后向上清液中加入0.4倍体积的7.5MNH4AC和两倍体积的无水乙醇,小心转动离心管以充分混匀,DNA立即形成白色絮状沉淀。小心挑出絮状沉淀团到5ml70%乙醇中洗涤两次,再用无水乙醇洗涤1次,自然风干(勿使沉淀完全干燥,否则极其难溶),加入适量TE缓冲液,4℃过夜溶解DNA。经脉冲电场凝胶电泳检测发现用这种方法提取的总DNA片段在90-160kb之间。DNA溶液中蛋白质及RNA的去除一般是用Tris饱和的苯酚或苯酚/氯仿抽提DNA溶液以除去溶液中的蛋白质。向DNA溶液中加入等体积的Tris饱和的苯酚或苯酚/氯仿(pH7.8-8.0),若DNA分子小于10kb,可采用剧烈振荡的方式充分混合有机相与水相,若DNA分子在10-30kb之间,可通过轻轻摇动进行混合,若DNA分子大于30kb,则需要轻轻转动和颠倒进行混合,以免DNA被剪切。离心分离两相,取上层的水相(DNA分子大于30kb时,应使用大口径吸管),重复抽提数次直至有机相与水相之间看不到白色物为止。最后用等体积氯仿抽提两次以除去可能残留在溶液中的苯酚。对于DNA样品中存留的的RNA,可以通过加入0.1倍体积的8MLiCl,混合后置冰浴中30分钟,15000g离心10分钟,取上清液而弃去沉淀物(大分子RNA),再向上清液中加入RNase至终浓度为20ug/ml,37℃,30分钟,即可沉淀DNA。有时在提取质粒和总DNA时,向粗提液中加入RNase到终浓度为10ug/ml,37℃水浴30分钟后,用上述方法去除蛋白质。