病原微生物胞内寄生机制的研究进展

中国热带医学2011年第11卷第1期CHINATROPICALMEDICINEVol.11No.1January2011［研究进展］胞内寄生病原体是指侵入宿主细胞并能在宿主细胞内繁殖的病原微生物。病原微生物可以通过各种侵袭途径进入宿主细胞，并选择适应自身生存的胞内生境进行寄生，但胞内寄生病原体必须进化出特异的策略以保证能在胞内生存，如结核分枝杆菌富含脂类的细胞壁，这是获得胞内生活方式的首要因素。胞内病原体的胞内生存机制是适应胞内生存方式而进化选择的产物。由于抗体不能进入细胞内，体液免疫对这类细菌感染的作用受到限制，因此寄主对胞内感染的防御功能主要靠细胞免疫，例如机体初次感染结核杆菌，由于细胞免疫尚未建立，吞噬细胞虽可将它们吞噬，却不能有效地将具消化杀灭，因此病原菌容易随吞噬细胞在体内扩散、蔓延，而造成全身感染。在感染过程中，机体在病原菌的刺激下逐渐形成细胞免疫，通过致敏淋巴细胞释放的各种淋巴因子，激活吞噬细胞，可大大增强其吞噬消化能力，抑制病原菌在吞噬细胞内生存，获得防御同种病原菌再感染的免疫力。NiebuhrK等发现细菌受体IpgD将PI-4.5P转化为PI-5P，并且这一脱磷事件受一种宿主细胞骨架复杂变化的诱导[1]。细菌能够利用哺乳动物细胞的信号脂成分来调控细胞的一系列功能，目前这种能力已经成为当今微生物致病性研究的主题之一。1侵袭途径1.1吞噬作用许多病原微生物借助于宿主细胞的收缩机制既能暂时又能持续感染专职吞噬细胞如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞。巨噬细胞和其它吞噬细胞是宿主抵御微生物入侵的首要防线，这些细胞从组织中迁移过来，摄取并降解外源颗粒，使吞噬体和病原微生物的接触频率增大。巨噬细胞表面携带一系列识别配体的受体，包括血清调理素、抗体和补体。激活补体旁路途径的病原体在它们表面聚集C3b和iC3b，由于巨噬细胞表面装配有对这些配体高亲和性的配体，CR1、CR3/CR4，这些受调理素作用的微生物将与吞噬体结合并被摄取。病原体所需的唯一特异机制是利于补体沉降而避免被插入的膜攻击复合物溶解，如沙门氏菌和利什曼原虫均是通过延长表面的脂多糖实现这一目的的。由于这些长的碳水化合物链使活化的转化酶与外膜之间保持一定的距离，虽能激活补体却不被溶解，补体受体引发吞噬，避免刺激巨噬细胞产生强大的过氧化爆发。寄生病原菌只需要很少的能量即可完成吞噬过程，如利什曼原虫、分枝杆菌和组织胞浆菌。在诱导胞吞和吞噬过程中，病原体通常诱导非吞噬细胞摄入微生物，目前对这种入侵途径及宿主细胞信号途径了解甚少。寄生病原菌经吞噬受体途径进入细胞，激活宿主细胞信号途径，吞噬体成熟为酸性的、水解活性的区室。因此，寄生病原菌如果不具备破坏这一过程的能力，所有被吞噬的病原将被释放到细胞的溶酶体系统。1.2诱导内吞和吞噬一些病原体通过自身配体的进化粘附宿主细胞，感染非专性吞噬细胞。病原菌利用III型分泌系统向宿主细胞释放效应蛋白刺激非专职吞噬细胞的摄入。沙门氏菌利用III型分泌系统分泌SPI1，在侵入细胞的过程中，诱导细胞骨架形成广泛的皱膜。一旦进入宿主细胞，通过磷酸化宿主细胞蛋白激活宿主细胞信号级联放大。Rodrigues等的研究表明，分枝杆菌可以调节巨噬细胞的程序性死亡，利于其在胞内的生存和播散[2]。Watarai等的研究发现，细菌III型分泌系统只有在IgN1阴性基因纯合的小鼠中启动胞饮细胞在细胞裂解中是有效的，这提示IgN1基因编码能抵制细菌III型分泌系统的产物，使得宿主对侵袭不敏感[3]。1.3主动侵入主动侵入指病原微生物不引发类似吞噬作用的任何收缩过程而侵入宿主细胞。事实上，对弓形体属而言，入侵的时间决定了入侵囊泡成熟为酸性溶酶体的区室的能力。所有的原虫，包括疟原虫、弓形体属、艾美球虫属具有称为Zoites的能动的侵袭阶段。这些阶段没有外部运动细胞器，只有螺旋形微管决定的地雷型的延伸。Zoites具有一个基于肌动蛋白的动力系统，可以介导滑行移动和侵入宿主细胞。肌球蛋白分子是与质膜成分相连的肌球蛋白A链和一个罕见的肌球蛋白轻链组成，能够以每秒大约一个体长的速度沿着肌动蛋白丝移动。这个收缩系统的外部表达依赖于寄生虫头部短丝、分泌器内的“MICs”膜蛋白家族，这些粘附分子带有一系列粘附区域，如血小板反应素域、表皮生长因子（EGF）域（MIC3）和苹果病原微生物胞内寄生机制的研究进展赵江丽1，2，陈宣男1，2，姜铮2，王芳2，袁静2*，甄清1*摘要：近年来随着微生物学和免疫学的发展，病原菌胞内寄生的研究越来越受到广泛的重视。现对病原微生物胞内寄生的侵袭途径、胞内生境以及不同病原体胞内生存致病的特点，以及近年来国内外的主要研究进展做一综述。关键词：胞内寄生菌；胞内生境；胞内寄生机制中图分类号：R37文献标识码：B文章编号：1009-9727（2011）1-119-04作者单位：1.吉林大学公共卫生学院，吉林长春130021；2.军事医学科学院疾病预防控制所，北京100071作者简介：赵江丽（1983~），女，硕士研究生，E-mail：[e-mail]*通讯作者：E-mail:[e-mail]；E-mail:[e-mail]fintracellularparasiticmechanismofpathogenicmicroorganisms.ZHAOJiang-li，CHENXuan-nan，JIANGZheng，etal.（1.PublicHealthCollegeofJilinUniversity，Changchun130021，Jilin，P.R.China）119CHINATROPICALMEDICINEVol.11No.1January2011中国热带医学2011年第11卷第1期域（MIC4）。在其他原虫包括艾美球虫属、隐孢子虫属和疟原虫中也发现了弓形体属MIC蛋白的同源分子。利用对抗微生物细胞松弛素D有抗性的弓形体属，对突变的宿主细胞的侵入试验可以证明收缩系统在侵袭中的作用，在药物的存在下，突变的寄生虫不论宿主表型如何仍可侵入宿主细胞。如果侵入过程被免疫球蛋白IgG调控抑制，宿主细胞上的Fc受体将阻止寄生虫在内含体的连续体外部维持分泌泡，分泌泡酸化，导致寄生虫死亡。反之，如果允许弓形体属侵入并感染宿主细胞，随后被二氢叶酸还原酶抑制剂乙胺嘧啶杀灭，分泌泡可以作为孤立的细胞内区室持续存在，这可能是由于宿主细胞膜不能识别它们所致，这些结果表明了侵袭路径与成功建立细胞内感染之间的内在联系。2胞内生存环境的选择胞内微生物在侵袭后采取不同的策略维持胞内感染。这些胞内病原体利用的胞内生存环境分为三种不同类型（图1）。第一种是侵入溶酶体，病原体持续存在于与宿主内质网相互作用的酸性水解的区室内，如利什曼原虫属、柯克斯(氏)体属和巨噬细胞内的沙门氏菌。第二种是侵入分泌泡，病原体持续存在于很少与宿主内质网作用的非酸性分泌泡内，这些病原体种类繁多，在胞内形成的分泌泡多种多样。例如疟原虫、弓形体属、军团杆菌属、衣原体和分枝杆菌属。第三种是侵入细胞质，病原体离开吞噬体存在于宿主细胞质内，例如T.cruzi、志贺氏菌、立克次体和李斯特菌。3不同病原体的胞内寄生机制3.1侵入溶酶体的病原体利什曼原虫具有鞭毛，可导致一系列严重程度不等的疾病，轻者叮咬部位损伤、重者出现内脏损害，寄生虫在肝脏和脾脏中复制而引起利什曼病。在感染墨西哥利什曼原虫的单层巨噬细胞中，利什曼原虫易形成大的分泌泡，内含大量的利什曼原虫，沿着分泌泡周围呈线状排列。分泌泡内呈酸性，含活性溶酶体水解酶，主要是组织蛋白酶B、L和D，具有水解酶的活性，但不能降解病原体，分泌泡里还有丰富的LAMP1和LAMP2（Igp110和Igp120）。利什曼原虫是嘌呤营养缺陷型，而溶酶体内这些嘌呤的浓度较低，需通过与自吞噬体融合，利用自噬体内的细胞溶质成分提供嘌呤。无鞭毛型利什曼原虫含有丰富的外部核苷酸酶，使三磷酸核苷去磷酸化，摄取并利用宿主的嘌呤。利什曼原虫采取逃避和通过I类和II类抗原分子呈递抗原来生存于完整的内质网分泌泡内。胞内无鞭毛阶段的原虫表面蛋白缺乏，被覆盖一层短的脂多糖（GIPLs），能够抵抗宿主溶酶体水解酶的降解。利什曼原虫在溶酶体内存活的关键可能在于它的鞭毛口袋，Inocêncio等通过利什曼原虫体外敏感试验发现，体前鞭毛经过预处理后可增强对宿主巨噬细胞的感染[4]。I类和II类主要组织相容性复合物分子，通过巨噬细胞分泌泡孔，结合原虫的肽段，递呈到感染细胞的表面，诱导T细胞反应导致释放激活巨噬细胞活性的细胞因子，这对原虫的生存是有害的。因此，利什曼作为胞内寄生病原微生物，其感染的免疫逃逸机制模型倍受研究者们关注。通过检测感染的巨噬细胞呈递外源性抗原的能力，揭示其诱导T细胞反应的能力略有降低，该效应是进入胞内后加载的，而不是MHCII类分子或共刺激分子的表达，作为合成MHCII类分子的新生链在细胞内必须结合恒定链才能正确加工和运送。当恒定链降解后，利于与合适的肽链结合形成II类二聚体的手套状物。最近对亚马逊利什曼原虫（L.amazonensis）感染的巨噬细胞的分析表明，在原虫寄生的分泌泡内既存在II类分子又存在恒定链。用半胱氨酸蛋白酶活性抑制剂处理感染的巨噬细胞后，恒定链的含量被提高。这些抑制剂阻断了宿主细胞溶酶体水解酶CathepinsB和L以及原虫半胱氨酸蛋白水解酶，这表明利什曼原虫降解MHCII类分子进而抑制宿主细胞的抗原提呈。不过，另外一些试验研究却表明原虫的酸性磷酸酶基因被激活后表达存在于胞质内、原虫表面或原虫的分泌泡内的蛋白。总之，宿主巨噬细胞的抗原提呈装置与原虫的孔型分泌泡的相互作用是功能性的，原虫很可能采用多种策略避免刺激免疫系统，减少抗原释放同时降解抗原提呈分子。对感染宿主来说识别感染病灶或自身感染细胞是至关重要的，所有有核细胞拥有主要组织相溶性抗原，能结合细胞内的肽段并将这些肽段提呈给T淋巴细胞，诱发细胞反应。3.2病原隐蔽于修饰的或独立的液泡在三种不同的细胞内病原群体中，病原隐蔽于修饰的或独立的液泡的这一病原群是最特异的。某些病原微生物如荚膜菌生存于溶酶体，可以和内体融合却不能酸化；沙门氏菌生存于酸性区室却不能象传统溶酶体那样发挥作用；分枝杆菌可以阻止它们的吞噬体正常成熟过程却不能和溶酶体融合。另外一些微生物如布鲁氏菌、军团菌、弓形虫、疟原虫、隐孢子虫形成一个区室完全隐蔽于正常内体之外，以逃逸宿主细胞的免疫防御。3.3非酸化的溶酶体研究表明，尽管荚膜菌可以和溶酶体及内体融合，但它们并不酸化，内在化后分析液泡pH达20min，揭示含有从酵母细胞壁制备的酵母聚糖的液泡很快酸化至pH5.5，而含有荚膜菌的液泡维持在pH7.0。3.4重构溶酶体区室沙门氏菌在细菌进入吞噬体的过程中通过诱导类似胞饮作用侵袭非专性吞噬细胞和巨噬细胞。近年来通过对沙门氏菌“致病岛”中基因的研究，对细胞内感染机制的理解取得了很大进展。致病岛SPI-1参与非专职性吞噬细胞的摄入，致病岛SPI-2在改变细胞内区室中起主要作用，对沙门氏菌在巨噬细胞内存活特别重要。含有沙门氏菌的液泡需要LAMP1，但不与含有溶酶体的液泡融合。巨噬细胞含有沙门氏菌的液泡表现一定程度的酸化，并且阻止吞噬体酸化，通过巴佛洛霉素A（一种ATPase抑制剂）减少细菌活力，这说明沙门氏菌在重构含有沙门氏菌的液泡之前，pH的降低对诱导细胞生存起很重要的作用。与紧致型吞噬作用相比，拉链型吞噬作用是通过许多颗粒的内在化实现，这些细菌诱导细胞膜发生“溅击”或皱膜运动，通过适当的液流捕获细菌。研究发现沙门氏菌的SPI-2基因通过SsrAB编码的双组分系统，在感染1-6h后显著上调表达。沙门氏菌SPI-2III型分泌系统递呈一系列效应蛋白，其基因并不都在致病岛内。SipC作为分子伴侣类具有帮助其它效应分子释放的功能，在含有沙门氏菌的液泡的感染细胞内，能观察到SifA,SseF和SseG都对鞭毛形成起主要作用。SifA缺失突变株感染细胞后，胞内细菌松散分布