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发酵染菌的危害•发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。本次学习的内容•灭菌或消毒前的准备工作•灭菌操作•染菌的后果﹑预防及处理•染菌分析•补充1﹑灭菌或消毒前的准备工作•1．1设备方面•1）消毒前空罐的准备主要有三个方面。（1）罐内外设备的检查。A、罐内传动设备如搅拌轴、搅拌叶、底瓦、拉杆的牢固、磨损、转动情况有无异常。B、罐内管路有无穿孔、堵塞、断裂。其中包括夹层或蛇形管的严密度检查。C、罐外设备、管路检查有无泄漏、堵塞。阀门换垫片。（2）罐内死角如罐壁、罐底、托板、蛇管、档板背后堆积物的清除。（3）罐体焊缝、阀门、法兰、三通的严密度检查，防止泄漏。•2）灭菌前要对设备严密度进行试漏抗生素发酵是一个无菌培养过程，必须在密闭的设备条件下进行。发酵过程中还必须进行接种，补加糖、油物料，加空气等工艺操作。发酵罐内虽然保持正压，但是一旦遇到突然停电、停空气、泡沫窜顶等异常情况，如果设备渗漏，将导致负压抽吸使发酵染菌。因此设备严密度是防止染菌的基本条件。•设备严密度试漏应包括哪些范围(1)罐体：包括轴封，进出料阀，移种补料阀，夹套进水及冷水回水阀，空气进罐阀，油、糖、酸、氟物料阀，取样及冲视镜阀，以及各阀所属的小排汽阀。(2)空气过滤器，法兰接口床垫，压力表丝口等。(3)油、糖罐(补料罐)：包括进空气阀、蒸汽阀、出料阀，以及各小排汽阀。(4)与单体罐相连结的各系统管道分配站阀及小排汽阀。上述各类阀门的阀座、阀芯、平面盘根，管件阀们的丝口，焊疤接口，都应进行严密试漏。•3）试漏方法•肥皂水试漏(1)设备容器和管道必须具有足够的工作压力(一般为0.08~0.1兆帕以上)。(2)被试漏的容器和管道不能有料液。(3)被试漏对象不能热烫。(4)管道及阀门要畅通。(5)被试漏处一定要有肥皂水浸湿。在试漏过程中通过眼看、手摸、耳听来仔细认真地进行观察和判断；不能放过一个泄漏点。•集气筒试漏法（用不到）用集气桶试漏的目的是：(1)检查罐上各管道(包括小排气管道)是否通畅。(2)检查罐上所有的管道及小排气阀的阀门蕊子是否有漏。使发酵罐的管道小排气终端都集中在一个排气桶中，将料液残渣、冷凝水及蒸汽等自小排汽阀排出。集气桶中盛满自来水，把下水阀关死。罐内充满空气，使具有一定工作压力。接着将罐上管道阀门及所有的小排气阀全关死，看集气桶内有无气泡泛出。如没有气泡，说明所有阀心都不漏。如果有气泡出现，看气泡在集气桶内的位置，与哪一条管路有关系，再进一步将该管路阀门关闭，小排气阀门开启，看该管路阀门是否有漏，再将小排气阀门关闭，管路上的阀门打开，看小排气阀门是否有漏。•1．2物料培养基实罐灭菌前要做到物料过筛入罐在培养基配制过程中往往会混入绳子、纸片等包装杂物。培养基成份中除少量可溶性糖、氮和无机盐外，大部分为颗粒性物料。有些原料如酵母粉、蛋白胨等在加热配制过程中往往易结团结块。有些原料如淀粉在配制过程或水解不完全时也会结成团块。根据热传递原理蒸汽接触颗粒加热时，颗粒的中心温度达到颗粒表面同样温度所需的时间(响应时间)和颗粒大小的直径有关，颗粒越大，响应时间越长，颗粒越小，响应时间越短。为了确保蒸汽的热穿透力，缩短响应时间，培养基在配制时必须做到物料过筛后进入罐内，一般控制筛孔直径为5~6mm，以有利于灭菌。•1．3人员灭菌操作时应注意的安全问题(1)压力容器的开盖或维修必须先切断压力源，确认无压力后方可进行，严禁带压开盖拆阀。(2)下罐检修或洗罐必须检查并确认搅拌电源已经切断，罐上有人监护方可下罐操作。(3)灭菌操作时应戴好劳防用品，开启阀门时人的身体应当侧向阀门，以防不测引起烫伤。(4)开启阀门时应事先确认管道的走向，防止气汽液料引入旁路。排汽时应防止排出的蒸汽冲及人身和电气设备。(5)高温操作时必须保护好罐上视镜玻璃，严禁用冷水冲洒或硬物锐器撞击而引起爆裂，亦减少向视镜内窥视以免发生人身事故。(6)产格遵守压力容器耐压规定。高温灭菌后的不得关死排汽和用冷水冷却，防止产生负压损坏设备(空消情况)。发酵车间复产时，消毒工还应根据复产总进度做好如下工作。(1)提前三天消总空气系统，做到无死角，消后吹干。(2)提前两天对种子罐进行预消，进无菌试验罐。(3)提前一天对发酵空间、下水道、取样漏斗进行甲醛消毒。(4)对各管路汽封、取样管汽封，可提前一天进行。2﹑灭菌操作•灭菌工艺控制点选择的依据是杂菌的含量尤其是芽孢杆菌的含量，被灭菌物料的性质，设备结构及死角，物料的体积，细菌的致死范围，总蒸汽的质量及压力，消后营养成份的破坏以及上述几方面的综合考虑。•实消过程中的三要素是:(1)发酵罐及附属阀门管线无泄漏，无死角、无堵塞。(2)灭菌时夹层或蛇管内冷水彻底排尽。(3)灭菌时做到进汽量分主、次，以加速热传递的对流，避免假压力。•2．1灭菌操作•2.1.1实消过程中要开动搅拌实消全过程中，开动搅拌的目的是：（1）使消毒灭菌的物料均匀受热，加速热传导及对流，避免假压力的形成。（2）避免物料的沉积、分层。实消过程中突然停搅拌怎么办?•2.1.2使用蒸汽前必须排尽蒸汽管道内的冷凝水蒸汽管道内由于常温的冷却作用必然有较多的残存冷凝水，冬季或较长时间未使用的蒸汽管道内残存冷凝水更多。这些冷凝水中夹带着大量铁锈及杂物，如不将其排尽，在通蒸汽时会直接引入罐内，或堵塞轧坏阀门，或者污染培养基和增加消后体积。尤其是在空气过滤器灭菌时会湿透过滤介质，降低过滤效率，甚至堵死纤维介质的过滤微孔，使之失效，所以必须在使用蒸汽前排尽蒸汽管道内的冷凝水。•2.1.3在灭菌过程中要控制好培养基的泡沫灭菌时，随着罐温的上升，培养基中的有机氮源因配比、品种、装量的差异，或者由于用汽不当会产生大量的泡沫。这些泡沫的内部是空气，由于空气的比热大，液体的比热小，泡沫便成为隔热层，蒸汽热量难以穿透，杂菌不易被杀灭。尤其是发生泡沫顶罐逃液，或在培养液表面形成厚厚的泡沫层都易使培养基灭菌不彻底，是灭菌操作应防止的弊病。选择适当的原料配比和培养基装量，提高原材料质量，消前适量补加油脂或者化学消泡剂，讲究合理的用汽操作可以防止在培养基灭菌过程中泡沫失控。实消过程中泡沫顶罐，无法控制进汽怎么办?•2.1.4灭菌操作中要以温度为主，压力为辅进行控制因为蒸汽压力与温度有一定的对应关系，一般情况下，灭菌时达到一定的罐压即表示该罐已达到了相应的高温。但是，若仅控制罐压，则并不完全可靠，因操作不当可能会出现温度不相对应的虚假罐压。例如冷空气未完全排净时显示的罐压可能偏高而实际温度并未达到。若排汽阀开得过大，可能罐压显示不高而实际温度超过。温度低了达不到灭菌要求，过高则破坏营养、损耗设备，因此，灭菌操作中必须要以温度为主，压力为辅进行控制。实消过程中罐压与罐温不一致怎么办?假压力产生的原因是什么?如何避免假压力?总之，实罐灭菌时必须注意操作过程中的合理用汽。(1)预热升温不宜太快，升温至100℃一般不少于40分钟，尽量排尽罐内冷空气。(2)避免蒸汽压力的骤增骤减，维持蒸汽压力的稳定和防止泡沫顶罐逃液。(3)保温时应注意各路蒸汽进汽的压力，使之均匀畅通无短路无堵塞。(4)保温过程中，罐压和温度应相对应，防止产生假压力和假温度。(5)进排汽的流量控制恰当，注意节约用汽。(6)严防高温高压闷罐导致培养基营养成份的破坏。实消过程中常见的问题•1)实消过程中罐压上升缓慢是什么原因?实消过程中加热升温升压的时间一般控制在30～40分钟，即可使蒸汽压力到达0.1MPa，温度达到118~120℃。这是正常的控制范围。如果超出以上时间，仍然达不到要求，需进行如下检查：(1)总蒸汽压力是否低于0.2Mpa。(2)罐上夹层或蛇形管进水阀、回水阀是否泄漏。(3)夹层或蛇管内冷水能否畅通排除。(4)进汽支管及阀门有无堵塞。(5)罐上压力表是否灵敏。(6)各支管进汽量控制是否适当。•2)总蒸汽压力低时如何进行实消灭菌?总蒸汽压力低于0.2MPa时(事先知道)，实罐消毒应注意如下工作。（1）灭菌前对空罐进行认真的清洗、检查，尤其是死角清除。（2）灭菌时，注意蒸汽量分主、次。强调底部进汽，注意手感检查传热。（3）注意冷却部位冷水排除干净。（4）在有条件情况下，合理调整发酵车间内灭菌罐的进度，确保实消用汽，必要时避开用汽高峰。•3)蒸汽含水量较大时如何进行实罐消毒灭菌？蒸汽含水量较大，说明蒸汽质量是湿饱和蒸汽。湿饱和蒸汽的温度低，穿透力差，灭菌效果不理想。在这种条件下进行实消灭菌可采取如下补救措施。(1)实消前采用空罐预消法，排除蒸汽中部分冷凝水，相对提高蒸汽质量。(2)也可采用支管放汽的办法，如取样管、罐底蒸汽在实消前大量排汽排水，相对地提高蒸汽质量。•4)如何防止灭菌过程中发酵罐玻璃视镜破裂?（1）灭菌过程中严禁超压工作。（2）经常检查发酵罐压力表灵敏度，防止失灵。（3）视镜紧固螺丝应受力均匀，不偏紧。（4）预热时，要待罐温上升后再开冲视镜蒸汽阀进汽。（5）灭菌时，视镜上应有遮盖物。（6）严禁在灭菌过程中贴着透视镜窥视。3﹑染菌的后果﹑预防及处理•3．1染菌的后果•3.1.1发酵罐污染杂菌后，可能会发生以下几种异常情况：（1）罐温升高。（2）pH值急剧变化。（3）化学测定的糖、氮、效价发生异常。（4）发酵液产生异味。（5）泡沫增多且不易消除。•3.1.2发酵染菌可能会影响抗生素产量发酵染菌都影响抗生素的产量，但影响程度会有不同。污染某些杂菌会阻滞抗生素的合成，而污染有一些杂菌则对抗生素的合成没有影响。即使染菌不影响抗生素的合成，仍然也会与正常产生菌争夺养料，使菌种生长不良。杂菌的生长又会改变发酵液的pH值，产生有毒代谢产物，产生降解抗生素的酶类，以及使发酵液粘度增加，导致难以过滤，使抗生素产量降低。污染芽孢杆菌的后果是什么?•3．2染菌的预防•3.2.1确保抗生素发酵过程中的纯种培养状态，从整体上必须做到以下几点:(1)抗生素发酵使用的生产菌种必须纯净不污染杂菌。(2)发酵罐及其一切附属设备如管件、阀门、容器均应无死角、无泄漏、无积垢，防止杂菌侵入。(3)发酵过程所引入的物料均应经过灭菌，符合无菌要求。(4)发酵罐内引入的空气应经无菌处理。(5)灭菌操作应做到科学、谨慎、合理，确保灭菌彻底。(6)发酵罐运转过程中防止形成负压。•3.2.2防治染菌特别是要加强无菌空气的管理（1）总空气过滤器及分空气过滤器的定期更换介质的管理制度。（2）总空气过滤器及分空气过滤器的定期消毒灭菌的管理制度。（3）空气过滤器各吹口(排气)，总管、支管各吹口定期检查的管理制度。（4）来源空气的温度、湿度及特殊气候条件下(比如夏天和冬天的空气湿度变化大)的相应规定。（5）空气系统无菌定期监测的管理制度(建议)。•3.2.3设备加工不良造成的渗漏预防属于制作加工不良的渗漏多发生在弯头和焊缝处。因此工厂在正式投入使用前，应进行适当的调研和试验，以保证所用设备或附件能适应工艺要求。设备极其附件渗漏而导致染菌的几率很高。因此，有必要对发酵用的设备及附件进行规范化的维修，这是非常重要的。•3.2.4其他•设备腐蚀导致的染菌:·化学腐蚀染菌防治通常通过选用耐腐蚀材料、添加缓蚀剂、控制及改善腐蚀环境（如降低冷却水中的氯离子）等措施，可以降低或防止化学腐蚀。使用防腐涂料也是防止化学腐蚀的有效措施之一，并在工业发酵中得到应用。·电化学腐蚀染菌防治电化学腐蚀常采用阴极保护法来防止，其基本原理是使要保护的金属成为阴极，由于阴极是还原反应，从而使金属得到保护。但对抗生素发酵设备的电化学腐蚀来说，几乎还没有保护的方法。·腐蚀染菌的防治磨蚀的防治方法一是对发酵用的培养基中的固体成分研磨到相当的细度。如美国施贵宝公司将培养基中的黄豆粉研磨到200目以下。二是设备定期检修时，应检查一下设备中受蒸汽、空气和其他流体冲击的部位是否被腐蚀，如被磨蚀应即使采取措施。•空罐灭菌空罐灭菌称为“空消”，即在未加培养基的发酵罐内通入饱和蒸汽进行湿热灭菌。空罐灭菌的压力和温度都可高于实罐灭菌，保温时间也可适当延长以保证罐体的彻