1直接反映基因特征,非推测-powerpointpre

DNA遗传标记特点：1.直接反映基因特征，非推测。2.基因座位数量多，无论表达与否。3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力强。4.适合于陈旧的样品，检测能力强。5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。6.易于检测手段的自动化、标准化，重复性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方法。第一部DNA基础一、DNA结构与特征1.DNA分子结构线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸组成----碱基、脱氧核糖、磷酸差别----碱基：嘌呤碱—腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）嘧啶碱—胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）结构：碱基+脱氧核糖=脱氧核苷-+磷酸=脱氧核苷酸2.DNA理化性质1）DNA的变性变性（denaturation）:在一定条件下，DNA双链间氢键断裂，形成单链结构的过程。也称退火（annealing）。条件：A：温度上升----Tm值(meltingtemperature)50%DNA分子解链的温度。与GC/TA比值有关。1%GC-0.4℃。B：碱性升高---0.5NNaOH-完全解链。2）DNA的复性复性（renaturation）撤除变性条件后，变性的单链DNA根据碱基互补的原则，恢复成DNA双链的过程。条件：A：温度降低—过低易错配。过高不易复性。B：高离子强度。3）DNA分子杂交杂交（hybridization）：来源不同的两条DNA单链根据碱基互补的原则，形成双链杂种DNA的过程。二、基因1.基因与基因组基因（gene）：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所需的全部核苷酸序列基因组（genome）：一个生物体的所有基因。核基因组：细胞核中23对染色体包含的所有基因线粒体基因组：线粒体DNA中的所有基因2.基因结构结构基因：能够编码产生蛋白质产物的基因。外显子（exon）：编码序列。内含子(intron)：非编码序列（间隔列）。如β珠蛋白-1700碱基（bp），编码146个氨基酸，3个外显子，2个内含子。3.基因突变突变（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改变。1）点突变（pointmutation）：单碱基置换。同义突变（samesensemutation）:简并密码，无突变效应。错义突变(missensemutation)：新密码子，氨基酸序列变化，产生突变效应。无义突变(non-sensemutation)：变成终止密码，合成不完整多肽产生突变效应。终止密码突变（terminatorcodonmutation)：合成过长的多肽，产生突变效应。移码突变（frame-shiftmutation)：DNA链中插入1个或几个单碱对，使突变处以下部位密码发生变化，使合成的氨基酸种类或序列变化，产生突变效应。2）片段突变：DNA链中小片段单碱序列发生缺失、重复或重排，产生突变效应。单碱基突变(图中用黑点示意位置为突变点)三、DNA多态性的分类1）长度多态性：等位基因片段长度的个体差别。由一特定序列，首尾相连串联重复次数不同产生的个体差别。可变数目串联重复（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）短串联重复(shorttandemrepeat,STR)A：产生原因：DNA滑动与同源染色体不等交换。B：差别：VNTRSTR重复序列组成2-7bp7-数十bp重复序列数目2-10数个10数个-数百个鉴别能力高极高优势扩增现象不明显极明显检测灵敏度极高稍差片段总长度200-500bp数千以上bpC：STR的命名：非编码区-D3S1358D3第三号染色体S单拷贝（singlecopy）1358VNTR序列的发现序号编码区内含子-HumHPRTB次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hypoxanthinephosphoribosyltransferase）1）序列多态性：DNA片段碱基排列顺序的个体差别。单核苷酸多态性（singleucleotidepolymorphism,SNPs）原因：碱基的置换、插入、缺失。特点：多位于非编码区，选择压力。数量多，1/1000bp，300万二态性，2个等位基因，多态性程度较低。孤立事件，人类遗传学意义大。第二部分DNA的制备核心与关键脑肺肌肉肾6pg/细胞一、理想DNA样品的要求1.纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。2.完整性-DNA大分子。3.DNA量。Μg/指纹图；ng/PCR；pg/PCR二、经典DNA提取法1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶解胞、核膜。2.去垢剂与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。3.有机溶剂去除蛋白，萃取DNA。4.乙醇与盐类沉淀DNA。三、试剂的使用原理1.弱碱和螯合剂：Tris-HClpH8.0，DNA分子稳定。EDTA（乙二胺四乙酸）-抑制核酸酶。通过螯合镁离子。2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）：增加膜通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋白质变性。蛋白酶K：酶解组蛋白。3.有机溶剂：酚-变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。PH6.0，需Tris-HClpH8.0平衡。氯仿-变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。异戊醇-除酚，除泡沫。4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。四、基本步骤1.样品处理-分离细胞，低渗盐水或细胞悬浮液。10mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS.2.消化-TNE（15mmol/LTris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA,5mmol/LNaCl）4ml，10%SDS0.45ml，10mg/ml蛋白酶K（终浓度100μg/ml）混匀，50℃3h，45℃过夜。3.DNA提取-等体积饱和酚-等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）-氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min.4.沉淀DNA-1/10体积3mol/LNaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇。室温挥干。5.溶解DNA-适量TE（10mmol/LTris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA,长时间。五、其他方法1.Chelex-100提取DNA基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基苯共聚物。基本方法：沉淀细胞；5%试剂200μl；56℃0.5h以上；100℃8min；剧烈震荡；离心上清。注意：离心彻底。2.硅珠法提取DNA基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性剂）与二氧化硅（硅珠，核酸吸附剂）。基本方法：血液（1-4μl）TES（100μl）SDS（20μl）煮沸5min；300μlGuSCN溶液与20μl硅珠液保温15min；离心；离心加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗；TES56℃10min离心取上清。3.直接煮沸法，100℃10min六.注意事项1.如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。2.消化时间宜长不宜短。3.操作轻柔。4.混匀要充分。5.挥干不宜过度。七.不同生物性检材的DNA制备1.混合斑二步提取法（精液与阴道液）原理：精子细胞膜富含硫醇蛋白，包裹DNA的鱼精蛋白富含半光氨酸，二硫键丰富，可抵抗蛋白酶作用。二硫苏糖醇（DTT）可还原二硫键，使蛋白酶发生作用。方法:(1)分离细胞成分。(2)常规消化。(3)加10%SDS40μl，1mol/LDTT16μl，10μg/μl蛋白酶K4μl，37℃过夜。(4)常规处理。八.DNA定量1.凝胶电泳半定量分析法标准参照分析。2.分光光度计分析原理：核酸于260nm波长为吸收峰，1OD值为50μg/μl双链核酸（40μg/μl单链核酸），根据OD值可计算DNA含量。蛋白于280nm波长为吸收峰，260/280比检测核酸纯度。1.6-1.8九.DNA纯化第三部分聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）在模板DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。一、PCR的基本过程1.变性（denaturation）:在加热的条件下（94℃左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。2.退火（annealing）：在降温的条件下（55℃-62℃），引物与其互补的模板DNA结合形成杂交双链。3.延伸（extension）：在合适的温度下（68℃-72℃），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸，由引物的3ˊ端为起始点，从5ˊ向3ˊ端延伸，合成新的与模板DNA互补的DNA链。每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到2×105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。二、PCR反应的体系标准体系为50-100μl，常用20μl。DNA模板/DNA聚合酶/一对引物/4种脱氧核苷酸/缓冲液。反应条件：95℃4-5min,94℃30s,55℃-62℃30s,72℃30-60s,30循环后72℃5-10min。三、试剂的要求：1.引物：人工合成的单链DNA。A：长度15-30bp。Ln=2×(G+C)+(A+T)38,延伸温度大。B：内部的互补序列。C：引物间的互补序列。D：序列的随机。E：识别序列的单拷贝。引物决定特异性。F：浓度：02-1μmol/L。G：应纯化低温保存。2.DNA模板A：量10ng左右。B：纯，无污染。3.DNA聚合酶A：根据具体实验要求选择。B：注意外切酶活性，5-3或3-5。C：活性最适温度70-75℃，半衰期一般95℃40min92℃130minD：镁离子依赖。第六章DNA多态性分型方法一、长度多态性分型扩增片段长度多态性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphisms,Amp-RLP）。主要指VNTR和STR1.步骤（1）PCR扩增，遗传标记特异性由特异性引物决定。（2）电泳分离PCR产物A：凝胶：聚丙烯酰氨凝（polyacrylamidegel,PAG），成分：丙烯酰氨与甲叉丙烯酰氨凝胶浓度（T）：6-8%，与分析的片段大小有关。交联度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨与甲叉B:载样缓冲液：甘油（蔗糖）密度重力，防扩散。泳速指示剂：溴酚蓝（5%，65bp）二甲苯青（5%，260bp）C：电压：100-200V（3）谱带显示：A：溴乙啶染色：ethidiumbromide,EB,嵌合与DNA双链间，紫外线激发红色荧光。注意：强致变剂。可加凝胶中或后染色。B：银染色：AgNO3，Ag+可与DNA稳定结合，甲醛还原Ag+颗粒，显黑褐色。比溴乙啶敏感度高。C：荧光显色:(P78)染料标记在引物5ˊ端，激光激发。（4）基因型判定：根据等位基因分型标准物（alleleladder）或片段长度标准物(molecularmarker)同步电泳比对判型。等位基因命名根据重复序列的重复次数。注意事项：出现3条谱带或3个峰时，污染、混合样品、变异。2.STR基因座的选择：A：重复序列为4个碱基。B：等位基因数量在10个左右。C：基因座距离足够远。D：引物识别序列尽可能单拷贝。E：PCR产物在100bp-300bp之间。3.多基因座复合扩增检测二、序列多态性分型（一）限制性片段长度多态性分析法restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPs因DNA核苷酸序列的变异，使DNA限制性内切酶识别部位产生、消失或移位，致使酶切片段长度和/或数量发生变化而呈现的DNA多态性。1.限制性片段长度多态性的DNA基础（1）识别部位的点突变：碱基的替换、修饰（甲基化）或插入与缺失。（2）识别部位间的片段插入与缺失。（3）识别部位间的重复序列数目的变化。2.DNA限制性内切酶restrictionendonuclease能够识别特定的DNA序列，与DNA分子结合后在特定部位将DNA双链切断的核酸水解酶。（1）生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。（2）命名：根据微生物的种（第一个字母大写）、属（前二个字母小写）、变种第一个字母大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。（3）分类：A：Ⅰ型：远离识别部位随即切割，非特异。B：Ⅱ型：在识别部位内部切割，特异。C：Ⅲ型：在识别部位后定点切割，特异。单位：1U：在标准条件下，