植物叶片染色质免疫共沉淀方法的优化

福建农林大学学报（自然科学版）JournalofFujianAgricultureandForestr^^University(NaturalScienceEdition)第47卷第3期2018年5月植物叶片染色质免疫共沉淀方法的优化张媛媛，黄冬梅，邓班，李丹静，张玉，缪颖(福建农林大学生命科学学院分子细胞和系统生物学中心，福建福州350002)摘要：以拟南芥成熟叶片为材料，探索3种不同型号超声破碎仪器的染色质免疫共沉淀（CMP)超声破碎条件.根据超声破碎结果推荐使用CovarisM220Focused-ultrasonicator仪器，并将该仪器破碎条件设置为10%dutycycle、75WattsIntensityPeakIncidentpower、200cycleperBurst、7丈bathtemperature、破碎时间12min时，可获得约500bp的DNA片段.同时，为检测不同H3K9ac抗体用量对染色质免疫沉淀效率的影响，通过半定量和实时荧光定量PCR检测确定初始量0.25g的拟南芥叶片所需H3K9ac抗体的最适用量为3^L.此外，以不同衰老程度的水稻旗叶为材料，根据上述破碎条件，进一步优化超声破碎时间，同样可以获得合适的DNA片段，根据优化的样品与抗体用量比例，通过免疫沉淀可以获得适用于后期实时定量PCR(ChIP-qPCR)和高通量测序（ChIP-seq)分析的DNA样品.关键词：叶片；染色质免疫共沉淀；超声破碎条件；抗体用量；免疫沉淀效率中图分类号：Q291文献标识码：A文章编号：1671-5470(2018)03-0329-07DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2018.03.010OptimizationofchromatinimmunoprecipitationassayinplantleavesZHANGYuanyuan，HUANGDongmei，DENGBan，LIDanjing，ZHANGYu，MIAOYing(CenterforMolecularCellandSystemsBiology，CollegeofLifeSciences，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，Fujian350002，China)Abstract：Thesonicationconditionsofchromatinimmunoprecipitation(ChIP)forthreetypesofsonicatormachinehavebeenex­ploredinthisstudy，andmatureleavesofArabidopsisthalianaweretakenasmaterials.Accordingtotheresultsofultrasonication，theCovarisM220Focused-ultrasonicatormachinewasrecommendedtoobtain500bpsizeDNAfragmentswiththeparametersby10%dutycycle，75WattsIntensityPeakIncidentpower，200cyclesperBurst，7丈bathtemperatureand12mincrushingtime.Meanwhile，wedetectedtheeffectofdifferentdosesofH3K9acantibodyonimmunoprecipitationefficiencyusingsemi-quantitativePCRandreal-timequantitativePCR.Itshowedthat3^LH3K9acantibodywasoptimalfor0.25gArabidopsisleaves.Inaddition，basedontheultrasonicconditionsmentionedabove，togetherwithfurthersonicationtimeoptimization，wealsoobtainsuitablesizeDNAfragmentsfromflagleavesatdifferentsenescencestagesinrice.Thenwithanappropriatesampleandantibodyratio，DANsamplesobtainedafterimmunoprecipitationweresufficientenoughforthesubsequentChIP-qPCRandChIP-sequencinganalysis.Keywords：leaf；chromatinimmunoprecipitation；sonicationconditions；dosageofantibody；immunoprecipitationefficiency迄今为止，已有多种方法用于研究蛋白质与DNA的互作，染色质免疫共沉淀技术（Chromatinimmuno­precipitation，ChIP)是用于检测蛋白质与DNA体内互作的有力工具[l，2].自Gilmour和Lis[3,4]创建ChIP技术以来，ChIP方法得到不断改进和完善.ChIP技术可与高通量测序（seq)、基因芯片（chip)、实时荧光定量PCR(qPCR)等技术联合使用，广泛应用于组蛋白修饰、核小体定位及转录因子结合位点检测等方面[5].ChIP技术的基本原理是在生物体生理状态下,利用甲醛使细胞核内DNA和蛋白质紧密交联,通过超声或酶试剂处理将染色质剪切成200〜1000bp的小片段，利用特异性抗体沉淀与靶标蛋白结合的DNA，最后解交联并纯化DNA片段[6].虽然ChIP技术应用日趋广泛，但ChIP试验步骤繁琐，多个因素限制了ChIP的效率[7].其中超声破碎条件和免疫沉淀效率是影响该试验能否成功的关键因素.样品量、破碎时间、功率及破碎强度等均能影响超声破碎效率[8,9].Ricardietal[10]以西红柿为材料，探索不同功率对染色质片段大小的影响，结果显示功率为20%时染色质片段最小最集中.与其他植物相比,拟南芥ChIP方法研究较收稿日期:2017-11-23修回日期:2018-01-19基金项目：福建省科技厅引导性项目（2015N0019);国家自然科学基金项目（31470383).作者简介：张媛媛（1991-),女，硕士.研究方向：分子细胞生物学.Email:[e-mail].通信作者缪颖（1965-),女，教授，博士生导师.研究方向：植物分子细胞生物学.Email:[e-mail].•330•福建农林大学学报（自然科学版)第47卷为深入.张丽丽等[11]较系统地探索了超声破碎仪的破碎时间、功率、间隔时间对拟南芥染色质片段大小的影响.李东明等[|2]利用另一型号超声破碎仪，优化了拟南芥野生型和突变体幼苗的ChIP方法.但是不同超声破碎仪器的条件需要重新设定和优化，并且不同植物其破碎条件也不尽相同.此外，抗体的亲和性和用量也是限制免疫沉淀效率的重要因素[13]，因此不同样品量对不同抗体的用量需要进一步确定.植物染色质构象变化参与调控植物的发育、衰老和胁迫响应过程,组蛋白修饰作为一种重要的染色质重塑机制之一,对基因的表达和抑制具有重要的调控作用[|4].利用ChIP技术可以研究特定基因以及全基因组范围的组蛋白修饰的变化[6].本试验以拟南芥成熟莲座叶为材料，比较和优化不同超声破碎仪器的破碎条件，同时探索了组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化（H3K9ac)抗体的用量对免疫效率的影响.利用上述最适的超声破碎仪条件和H3K9ac抗体用量，以水稻旗叶为材料进行ChIP试验,获得的DNA片段可以成功用于后续的实时定量PCR(ChlP-qPCR)和高通量测序（ChIP-seq)分析.1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料植物材料是在人工气候室培养的野生型拟南芥（Arafei'dopM's认a/i'araaL.CoZum^i'aeco-type)和水稻日本晴品种（OryzasahWL.cv.Nipponbare).拟南芥生长条件为:温度22丈，相对湿度60%RH，光照时间13h，黑暗时间11h.选取抽薹后完全展开的莲座叶（约7周）作为试验材料.水稻生长条件为:温度28〜32丈，光照时间16h，黑暗时间8h.水稻小穗完全从叶鞘中抽出时，取其旗叶作为第1周的试验材料，以后每隔1周取材1次，共取6次，分别记作1周、2周、3周、4周、5周、6周.1.1.2仪器与试剂本试验所使用了3种超声破碎仪器,分别为：BandelinSonopulsHD2070，CovarisM220Focused-ultrasonicator、BioruptorPlus.其中BandelinsonopulsHD2070为探头式超声破碎仪，而其他两种破碎仪器为非接触式超声破碎仪.荧光定量PCR仪型号：CFXConnect(BioRad).Microcloth(475855-1RCN)、蛋白酶抑制剂CompleteProteaseInhibitorCocktail(04693116001)购自罗氏公司、抗体H3K9ac(07-352)购自默克密理博公司.1.2方法参考Gendreletal[15]的方法，对试验条件进行优化.1.2.1染色质交联将0.75〜1.50g拟南芥莲座叶置于装有37mL的1%甲醛溶液的50mL离心管中，真空交联15min，缓慢释放真空.然后加入2.5mL2mo卜L_1的甘氨酸溶液，继续抽真空5min终止交联反应后，再次慢慢释放真空.用40mL双蒸水洗涤叶片3遍后，将材料上的水吸干置于液氮中快速冷冻，之后可置于-80丈冰箱保存,也可以继续进行试验.1.2.2细胞核的提取在液氮中充分研磨叶片，然后转移叶片粉末到装有30mL提取液1(配方:0.4mol•L-1蔗糖、10mmo卜L-1Tris-HCl(pH8)、10mmo卜L-1MgCl2、5mmo卜L-1P-ME、0.1mmo卜L-1PMSF、蛋白酶抑制剂）的50mL离心管中，在4T；下孵育15min，然后用4层Microcloth过滤至冰上预冷的新的50mL离心管中.4丈，5720r•min-1离心20min，去除上清液.用移液枪吸取1mL提取液2(配方:0.25mol•L-1蔗糖、10mmo卜L-1Tris-HCl(pH8)、10mmo卜L-1MgCl2、1%TritonX-100、5mmo卜L-1P-ME、0.1mmol•L-1PMSF、蛋白酶抑制剂），缓慢吸打重悬沉淀，将重悬液移入新的1.5mL离心管中.4T，11440r•min-1离心10min，去除上清液，用300^L提取液2重悬沉淀.将重悬的溶液缓慢加到装有1.5mL提取液3(配方：1.7mo卜L-1蔗糖、10mmo卜L-1Tris-HCl(pH8)、2mmo卜L-1MgCl2、0.15%TritonX-100、5mmo卜L-1P-ME、0.1mmo卜L-1PMSF、蛋白酶抑制剂）的2mL离心管中,4T，13210r•min-1离心1h.去除上清液，每0.75g起始叶片用320pL细胞核裂解缓冲液（配方:50mmol•L-1Tris-HCl(pH8)、10mmol•L-1EDTA、1%SDS、蛋白酶抑制剂）重悬沉淀，后续进行超声破碎.1.2.3染色质超声破碎超声破碎是染色质共沉淀的关键步骤之一,染色质片段的大小对染色质免疫共沉淀后期分析具有显著影响，染色质片段太小或者太大会导致后期PCR分析结果呈现假阴性或假阳性，第3期张媛媛等:植物叶片染色质免疫共沉淀方法的优化•331•同时染色质片段太大不利于测序分析[16].超声破碎后染色质片段约200〜1000bP,不同的超声破碎仪器、破碎条件和样品都会影响破碎的效率[17].本研究对3种超声破碎仪器的破碎条件进行探索，超声破碎仪器和条件设置