Mini-Reviews小型综述微生物学报ActaMicrobiologicaSinica54(10):1109-1115;4October2014ISSN0001-6209;CN11-1995/Q.im.ac.cn/actamicrocndoi:10.13343/j.cnki.wsxb.2014.10.002基金项目:国家重点基础研究发展计划(2013CB430004);国家自然科学基金项目(41103040);中央高校基本科研业务费项目(XDJK2014C104);重庆市自然科学基金项目(cstc2011jjA0390)*通信作者。Tel:+86-23-68250100;Fax:+86-23-68250444;E-mail:aigara@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp;aigara@swu.edu.cn作者简介:杜红霞(1980-),女,黑龙江牡丹江人,环境微生物学博士研究生,方向为厌氧微生物对汞的甲基化与去甲基化研究。E-mail:dhx13@163.com收稿日期:2013-12-24;修回日期:2014-02-23汞在微生物中的跨膜运输机制研究进展杜红霞1,2,YasuoIgarashi1,2*,王定勇21西南大学生物能源与环境修复研究中心,重庆4007152西南大学资源环境学院,重庆400715摘要:甲基汞是一种强亲脂性、高神经毒性的有机汞化合物,可以通过生物富集或生物放大造成人类甲基汞暴露。环境中甲基汞的产生主要是厌氧微生物所调控的无机汞的甲基化。主流观点认为厌氧微生物对汞的甲基化是一种细胞内反应,因此,甲基汞的产生速率不仅与环境中具有汞甲基化能力的厌氧微生物的存在与活性相关,同时也与无机汞在微生物细胞中的跨膜运输过程有着重要联系。要明确无机汞经微生物甲基化的机制,就必须了解无机汞被微生物细胞生物吸收的过程,即无机汞在微生物中的跨膜运输路径。目前研究认为该过程主要有Mer抗汞操纵子转运体系、被动扩散、促进扩散和主动运输4种路径。本综述主要围绕无机汞被微生物细胞生物吸收的这4种路径展开,将系统介绍科学界对这4种路径的最新研究进展,并对相关研究进行展望,指出无机汞经促进扩散或主动运输进入到微生物细胞内将是未来研究的重点。关键词:汞,微生物,甲基化,跨膜运输中图分类号:Q935文章编号:0001-6209(2014)10-1109-07汞是环境中毒性极强的重金属元素之一,有零价、正一价与正二价3种价态。虽然所有形态的汞皆具毒性,但相较于无机汞,有机汞毒性更高,特别是甲基汞。甲基汞是一种强亲脂性、高神经毒性的有机汞化合物,经食物链生物富集造成人类甲基汞暴露[1]。20世纪50年代,日本发生的水俣病(MinamataDisease)事件使人们充分认识到甲基汞对人体和动物的毒害。因此,对自然环境中汞甲基化的研究具有十分重要的意义。自然环境中,无机汞的甲基化主要有生物甲基化和非生物甲基化两种形式;大量研究已经证明,非生物甲基化率较低,在自然条件下甚至可以忽略,甲基汞主要来自生物甲基化作用[2]。甲基化微生物主要是水体及底泥中的一群厌氧微生物,特别是δ-变形菌纲的硫酸盐还原菌(Sulfatereducingbacteria,SRB)及铁还原菌(Ironreducingbacteria,IRB),它们具有甲基化的共同关键基因,即美国橡树岭实验室Parks等最新发现并命名的hgcAB基因[1]。厌氧微生物对汞的生物甲基化,大量研究都指向细胞内反应[1,3-4],这就意味着无机汞在甲基化之前如何进入微生物细胞内是极为关键的过程[1,4-6]。该过程必然涉及到汞穿过细胞外膜、外周胞质、细胞HongxiaDuetal./ActaMicrobiologicaSinica(2014)54(10)内膜到达细胞质的全过程。那么,具有hgcAB基因的这群厌氧微生物,通过何种路径进入到微生物细胞内,并在细胞内发生生化反应合成了甲基汞?本文将对国内外在汞生物吸收路径方面的研究进展进行综述,并对未来的研究重点提出展望,希望对开展汞的微生物甲基化机理方面的研究有所启迪。1汞生物吸收的路径科学家经过研究认为,Hg2+首先进入外周胞质区,进入的方式可能是亲脂性Hg2+经被动扩散穿过细胞外膜,或者是亲水性汞及其它汞化合物,如硫醇汞,经促进扩散穿过细胞外膜[7]。Hg2+穿过细胞内膜的方式,目前公认的主要有4种[7]:Mer抗汞操纵子转运体系(Mer-basedtransportsystem)、被动扩散(Passivediffusion)、促进扩散(Facilitateddiffusion)和主动运输(Activetransport)(图1A-D[7])。1.1Mer抗汞操纵子转运体系Mer抗汞操纵子转运体系是目前为止科学界对于汞与微生物之间的互动研究得最为彻底的机制。细菌对汞的抗性研究始于20世纪60年代。细菌对无机汞和有机汞化合物的抗性是细菌最广泛关注的表型之一。对所有生命体而言,汞并没有任何生化功能。长期处于汞毒害环境中的微生物已演化出一套独特的抗汞操纵子(meroperon)基因系统(图1-A[7])。图1.无机汞穿过细胞膜进入细胞质的几种方式[7]。A:Mer抗汞操纵子转运体系;B:被动扩散;C:促进扩散;D:主动运输Figure1.PossiblepathwaysofinorganicHg2+enteringintothecytoplasmofmicrobialcells[7],A:mer-basedtransportsystem;B:passivediffusion;C:facilitateddiffusion;D:activetransport.Reprintedwithpermissionfrom“MechanismsRegulatingMercuryBioavailabilityforMethylatingMicroorganismsintheAquaticEnvironment:ACriticalReview”.Copyright(2013)AmericanChemicalSociety.在Mer抗汞操纵子转运体系中,Hg2+的吸收由转运蛋白来调节,其中MerP、MerC、MerT和MerA转运蛋白发挥了重要作用。MerP编码的蛋白为二聚体,位于细胞周质;MerT编码的蛋白为三聚体,位于细胞膜内。MerA编码的汞还原酶位于细胞内,为蛋白二聚体。由图1A可知,MerP转运蛋白在外周胞质与HgX2连接,将Hg2+传递给MerT转运蛋白,之后MerT又将Hg2+转移至MerA转运蛋白,并在MerA发生还原反应(反应式1)。在这套诱发汞的去毒系统里,除了能将汞带入细胞内的MerT与MerP转运蛋白之外,最重要的成员是MerA。由上可知,MerA是位于细胞质的二价汞还原酶,是一种主要的脱毒蛋白酶,可依靠NADPH为电子供体催化Hg2+的还原,将毒性较高的离子态二价汞还原成毒性较低且挥发性高的零价元素汞;随后将元素汞自细胞内排出,挥发到大气中。Hg2++NADPH+OH-→MerAHg+H2O+NADP+反应式(1)然而,对于Mer抗汞操纵子转运体系学说,科学家对此仍旧有很多的疑惑:(1)并不是所有具有汞甲基化能力的厌氧微生物的基因组都具有Mer序列[8-9],并且,大多数分离出的具有汞甲基化能力的0111杜红霞等:汞在微生物中的跨膜运输机制研究进展./微生物学报(2014)54(10)厌氧菌为G-菌[2,10],而该路径主要存在于G+菌中,因此一定有其他路径。(2)该体系并不存在于具有甲基化汞能力的硫酸盐还原菌及铁还原菌[5,11],有关该体系的证据都是基于不具有汞甲基化能力的厌氧菌上。(3)Mer抗汞操纵子家族还有一个参与有机汞降解的MerB转运蛋白,它可将有机汞C-H键打断,降解为Hg2+[12](反应式2),Hg2+再经MerA还原为元素汞(反应式1)。然而,科学家对于硫酸盐还原菌或铁还原菌采用甲基化作为汞的去毒机制也持怀疑态度,或者说找不到合理的理由来解释这种行为。因为对微生物来说,甲基汞带来的毒性并不亚于无机汞[13-14]。而且,甲基汞中的汞仍属二价态汞,所以多数科学家认为其依旧能与微生物体内的含硫物质如氨基酸等轻易键结,而无法像元素汞那样迅速自细胞内扩散出去。因此,微生物为什么要去做对自己本身无益的事情?R-CH2-Hg++H+→MerBR-CH3+Hg2+反应式(2)1.2被动扩散科学界对于汞的甲基化过程推定为非抗汞机制之后,出现大量研究将该过程指向为被动扩散[15-19]。所谓被动扩散,指的是汞离子在浓度差或电位差的驱动下,不需要任何特定转运介质或载体的协助而通过膜转运的一种形式,该过程不需要能量(图1-B[7])。当前研究认为,无机汞经被动扩散(或促进扩散)穿过细胞外膜进入细胞周质后,再经被动扩散进入细胞质是汞在微生物细胞膜上最主要的传输机制;也就是说,主流观点认为:不带电、分子量小、膜透性高的Hg2+化合物,如HgCl2、Hg(HS)2等,特别是汞硫配合物,经被动扩散进入到细菌细胞内的学说是最广为接受的无机汞之细胞膜传输机制[17-23]。如果被动扩散成立,那么汞在胞外环境里的化学形态,即汞的赋存形态及其化学稳定性,是其生物可利用性的重要决定因素。汞是一种常温下呈液态的金属,自然界天然存在的汞化合物是汞的硫化物,如天然的硫化汞朱砂、黑辰砂。可见,汞极易与含硫分子发生反应,尤其是还原态硫,并形成难溶性沉淀物或水溶性配合物。在模拟汞生物可利用性的模型中使用最多的就是假设厌氧水体中,微生物主要经被动扩散吸收汞。这种情况下,人们推测中性不带电荷的、小的、可溶解的Hg2+化合物如Hg(HS)20、HgS0(aq)能够被具有甲基化能力的厌氧微生物所吸收,而HgHS+、HgHS2-以及Hg-DOM等形态汞则不能经被动扩散进入到细胞内(图2[7])。在水体中可溶解的无机汞达到化学平衡态时,各式各样的汞硫配合物是孔隙水中可溶解汞的主要形式[24]。因此,甲基汞的净产量与中性的汞硫配合物相关,该结论最早是由Benoit等在1999年率先提出的[20-21]。从微生物的角度来看,细菌细胞膜的结构是脂质双分子层并镶嵌有多种蛋白质,具有选择性渗透作用,与细胞壁共同完成细胞内外的物质交换,细胞膜上的多种酶可参与生物合成。细菌细胞膜内层是由两段疏水性或亲脂性极强的脂肪酸所组成。如果汞离子能够以被动扩散方式进入细菌体内,此物质必须不带电,如此才能溶于细胞膜,该物质也必须是像O2、CO2、H2O这样的小分子物质,如此才能穿过细胞膜。从这个角度再次证明了不带电荷的小分子化合物HgS0(aq)和Hg(HS)20较有可能穿过细胞内膜而进入细胞质并进行后续的生化反应。图2.汞生物可利用性模型假设小的、中性不带电荷的、可溶解汞硫配合物经被动扩散进入微生物细胞内[7]Figure2.Bioavailabilitymodelpostulatesthatonlysmall,neutrallychargeddissolvedHg-sulfidecomplexescanbetakenupbymethylatingmicroorganismsthroughpassivediffusioninanaerobicporewater.Reprintedwithpermissionfrom“MechanismsRegulatingMercuryBioavailabilityforMethylatingMicroorganismsintheAquaticEnvironment:ACriticalReview”.Copyright(2013)AmericanChemicalSociety.早期许多科学家的研究结果,证明了汞主要经被动扩散被具有汞甲基化能力的厌氧微生物所利用的假设。淡水底泥实验得出,硫化物在甲基汞的生成过程中发挥了重要作用[15],并进一步得出硫化物含量在10到300μmol/L时最为显著,高于300μmol/L时