整理生物化学与分子生物学实验

生物化学与分子生物学实验1.分光光度计（1）基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中，其吸光度值与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，即遵循朗伯—比尔定律，通过也在一定液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓度。（2）吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为：A＝-lgT＝εbcA：吸光度，又称光密度“O.D”；ε：吸光系数（L·mol－1·cm－1）；比例常数，称吸光系数b：样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，则b=1cm；c：样品浓度（mol/L）。吸光度“A”具有加和性,即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数=8.2×103M-1cm，计算其摩尔浓度.∵A＝εbC∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10-5mol/L（2）等电点的计算方法；标准曲线的制作（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。（2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。（3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。（4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。2、酪蛋白的提取过程：(1).原理；牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，它是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.8。利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质，将牛乳的PH调至4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯化的酪蛋白。(2).主要试剂：牛乳醋酸钠缓冲液0.2M,PH４.6，乙醇，乙醚，氢氧化钠PPT后面问题：（1）醋酸缓冲液、蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么？醋酸缓冲液：调节PH到等电点4.8。蒸馏水：出去沉淀中的可溶物。乙醇：除去沉淀中的脂类物质。丙酮洗涤：脱水。（2）最后所得的沉淀中加入0.1mol/LNaOH的作用是什么？酪蛋白是酸性蛋白质，溶解于碱性溶液中，方便下次双缩脲法测定。（3）制备高产率酪蛋白的关键是什么？刚开始时对牛奶的ph的调节,最好是调节到4.7,越接近越好,这是最主要的。（4）请设计另一种提取酪蛋白的方法。1、向酪蛋白溶液中加入高浓度(NH4)2SO4溶液2、10000转/分,5分钟，去上清液3、95%乙醇4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液4、丙酮4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液5、0.1mol/LNaOH2ml加水至10ml3、双缩脲法测蛋白质含量(1).蛋白质测定的5种方法:凯式定氮法（Kjedahl法）紫外吸收法双缩脲法（Biuret法）Folin-酚试剂法（Lorry法）考马斯亮蓝法（Bradford法）TCA：三氯乙酸4.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合，使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。在595nm下测定的吸光度A595，与蛋白质浓度成正比。(1).干扰物质有哪些？TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等(2).G250与R250的区别：比考马斯亮蓝R250多二个甲基，染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。(3).PPT后的4个思考题。说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量，哪几种只能测定其相对含量，为什么？只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量，因为每6.25蛋白质含1g氮，试验中可以除去非蛋白氮，所以，通过氮含量的测定，可以得到蛋白质的绝对含量。其他的几种方法，由于都使用了标准蛋白制作标准曲线，所以，所测得的未知蛋白的含量，都是相对于标准蛋白含量而言的。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些？(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质时有较大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同的标准蛋白。(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等。(3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。在实验中，使用的水一定是蒸馏水吗？为什么？因为Bradford检测中要用的试剂配制,标准曲线的制作都要用到水.如果不是使用蒸馏水,可能水里面会有一些游离的离子或者电解质,会影响试剂配制的准确性,干扰实验结果.而水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝发生变色反应,这样制作的标准曲线会比实际值偏高,导致最终浓度检测的结果比实际结果偏低。SDS干扰考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么？当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。由于SDS的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。5、醋酸纤维薄膜电泳原理：生物分子在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向不同分子以不同速度移动。电泳影响因素：蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量、自身大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的PH、离子强度等。(1).结合实验报告册，回忆操作过程，首先醋酸纤维薄膜先看粗糙面，在粗糙面上画点样线，画好后做标记，泡在缓冲溶液中浸泡完全（上面无白斑），然后点样，点样后放掉电泳槽中电泳，电泳后染色，然后脱色。（熟悉整个过程，如果把过程打乱，能否正确排序？）（选择题）结果是5条带，哪条带最接近点样线，哪条线最远。要求会画图，画图要记得画点样线。(2).血清蛋白的临床意义。组成：白蛋白、α1、α2、β和γ-球蛋白;功能：维持血浆胶体渗透压；调节血浆pH值，维持酸碱平衡；运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等；免疫作用。血清蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为60～80g/L减少：长期慢性发热、大面积烧伤（白细胞增多），恶性肿瘤、肝癌（淋巴细胞和核细胞增多），肝功能严重受损、肝坏死、肝硬化（谷丙转氨酶增多），甲状腺功能亢进、浆膜渗出性损害、结核病、慢性腹泻、慢性肝炎、肾病综合征、吸收不良综合征，营养不良、贫血（红细胞，红蛋白稍偏低）等。增加：大量出汗、多发性骨髓瘤、腹泻、巨球蛋白血症、严重呕吐、中毒等。6、血糖测定（吴宪血糖测定法）(1).吴宪血糖测定法的优势（波长620nm）:优点：灵敏度高，比双缩尿法灵敏得多工作原理：葡萄糖＋Cu(OH)2→Cu2O↓Cu2O＋磷钼酸→钼蓝钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比，所以可以用比色法来测定钼蓝的光吸收值来测定血糖的含量（波长620nm)。（2）为什么选用无蛋白血滤液？有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应，也呈蓝色，干扰最后的结果（3）水浴8min后，取出为何切记摇动？氧化亚铜易已被氧化（4）空腹血糖的正常范围：一般空腹全血血糖为3.9～6.1mmol/L(70～110毫克/分升)，血浆血糖为3.9～6.9mmol/L(70～125毫克/分升)。空腹全血血糖≥6.7mmol/L(120毫克/分升)、血浆血糖≥7.8mmol/L(140毫克/分升)，2次重复测定可诊断为糖尿当空腹全血血糖在5.6mmol/L(100毫克/分升)以上，血浆血糖在6.4mmol/L(115毫克/分升)以上，应做糖耐量试验。当空腹全血血糖超过11.1mmol/L(200毫克/分升)时，表示胰岛素分泌极少或缺乏。因此，空腹血糖显著增高时，不必进行其它检查，即可诊断为糖尿病。（5）PPT后的3个思考题Folin-吴宪法为什么要用无蛋白血滤液？有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应，也呈蓝色，干扰最后的结果Folin-吴法测定血糖的优缺点是什么优点：灵敏度高，比双缩尿法灵敏得多，缺点是费时，要精确控操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性比较差，干扰物质比较多进行比色法测定时，如果测得样品的A值超过100%，该如何处理，为什么？测得样品值超过100%是因为有其它还原物质，使其待测液中血糖的浓度过高所造成的，应该将待测液稀释后再进行比色。7、谷丙氨酸酶的临床意义；（1）、谷丙氨酸酶的测定方法；知道什么是赖氏法，什么是改良赖氏法？（2）、改良后的方法优势在哪？1.反应温度：40℃改为37℃；2.底物浓度：高改低；3.套用卡门氏单位，与速率法一致，反映了酶的真实活性（3）、在做实验时用到α—酮戊二酸、丙酮酸、硝基苯肼，他们的原理以及试剂的作用；（4）、该实验的注意事项：2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙硝醌化合物；溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定结果；在测定时，如酶活力较大（大于150KarU），应将样品稀释后再进行测定。（5）、PPT后的6个思考题1、ALT的临床意义?AST的测定对于肝病的诊断具有十分重要的意义，特别是AST/ALT比值大小对于临床判定肝病严重程度具有十分重要的意义，是临床诊治肝病的重要指标之一2、血清谷丙转氨酶测定的注意事项？以及为何要避免溶血？常温下标本不宜久存，（2）严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照组（3）当标本的酶活性超过150K时，应将血清中用0.145mol/L氯化钠稀释重做，其结果乘以稀释倍数（4）酮戊二酸，2,4-二硝基甲苯肼是直接显色物，NAOH的浓度与显色深浅有关，因此它们的浓度必须很准确（5）丙酮酸标准浓度要求十分精确（6）加入2,4-二硝基苯肼溶液之后应充分混匀当溶血之后，红细胞中的ALT会进入血液中，导致测得的实验数据较大，不符合实际情况3、对照管的意义是什么?减少非试验因素对实验结果的影响4、底物液为何要37℃预温5min?人体的体温为37℃，只有在此温度下酶的活性才会达到最大，因此必须先让酶的活性达到最大才与底物反应5、为什么在制作标准曲线时要加入基质液？使反应的溶液体积相同，减少因体积不同而造成的实验非决定性因素的影响6、为什么在制作标准曲线时加入基质液的体积不同，对反应没有影响？基底液与底物和酶都不反应，它的作用只是调节溶液的体积酶活性的单位：国际单位：1961年酶学委员会建议使用统一单位，在规定条件下，1分钟内转化1μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。8、猪肝ＤＮＡ基因组ＤＮＡ的提取实验原理一定要掌握。提取过程中用到的试剂作用；PPT后的思考题（1）实验原理：DNA与RNA的分离：DNP在0.14MNaCl盐溶液中溶解度很低，而RNP则溶于0.14MNaCl盐溶液，利用这一性质可将生物组织中的DNA与RNA分开。DNA在高浓度的盐溶液中溶解度最大。去除DNP中的蛋白：SDS使之变性除去（同时破坏核酸分解酶）。进一步纯化则利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白，震荡时，蛋白质变性，形成凝胶，并与DNA分开，DNA则留在水层中。沉淀DNA：利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇将DNA从溶液中沉淀出来