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华南师范大学实验报告学生姓名学号：专业：化学师范年级、班级：09级化四课程名称：近代有机分析方法和实验实验时间：2011年11月9日实验六：高效液相色谱法用于有机农药残留的分离和分析【实验目的】1、应用高效液相色谱法对磺胺类抗生素的定性和定量检测2、学习谱图和数据的处理方法【实验原理】磺胺族抗生素包括磺胺嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺甲噁唑，等,被广泛应用到水产、畜禽类养殖中。它们被添加到动物饲料中,以促进动物的生长以及防治各种疾病,如果不能严格控制停药期,很容易造成在动物肉和组织中残留,给人体健康带来危害,因此世界各国对畜禽肉中的磺胺族残留都有严格的限量要求。GB/T5009.116-2003用液相色谱法检测畜禽肉中的磺胺类药物残留量,操作简单快速,但是该方法灵敏度比较低。【实验仪器与试剂】仪器：岛津液相色谱仪，SPD-20A检测器，LC-20AT泵，微量进样器，C18色谱柱试剂：磺胺嘧啶标准溶液，磺胺吡啶标准溶液，磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合液（1：1），乙腈（AR），0.05%甲酸溶液样品部分物理参数：样品分子式分子量熔点外观溶解性磺胺嘧啶C10H10N4O2S250.28252-258℃白色或类白色结晶或粉末，无臭无味，遇光色渐变暗溶于稀盐酸，微溶于乙醇或丙酮，几乎不溶于水，易溶于氢氧化碱溶液或氨溶液磺胺吡啶C11H11N3O2S249.49191-193℃黄棕至白色粉末微溶于水【实验步骤】1、准备1.1准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。（这里用的是流动相是乙腈(B)和0.05%甲酸溶液(A)，分别用有机相系和水相系的0.45µm滤膜过滤，超声脱气20min。）1.2根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。1.3配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。（即分别称取0.10g的磺胺嘧啶、磺胺吡啶用甲醇定容至100.0mL，用0.45µm滤膜过滤（先在一次性注射器加上0.45µm滤膜，然后把活塞杆拉出来，把要过滤的溶液倒进去再把杆推进滤出溶液。）得到磺胺嘧啶和磺胺吡啶的标准液分别为1mg/mL（1000ppm）。分别吸取磺胺嘧啶和磺胺吡啶标准溶液各5mL，置于10mL容量瓶中磺胺吡啶和磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合0.5mg/mL（500ppm）。1.4检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。2、开机接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站（即电脑桌面上的CS-LightRealTimeAnalysis）。3、参数设定3.1波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键接着按[Enter]键，用数字键输入所需波长值281nm，按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。,w43.2流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1.0mL/min），按[Enter]键确认。按[CE]键退出。3.3流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按[conc]键，用数字键输入流动相B乙腈的浓度百分数(17%)，按[Enter]键确认。按[CE]键退出。4、更换流动相并排气泡4.1将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；4.2逆时针转动A/B泵的排液阀180°，打开排液阀；4.3按A/B泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；4.4将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。4.5如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。4.6如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为5ml/min，按[pump]键，冲洗3min后再按[pump]键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。5、平衡系统5.1按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开在线色谱工作站软件，输入实验信息并设定各项方法参数后，按下数据收集页的[查看基线]按钮。5.2等度洗脱方式;g5J;Q5.2.1按A泵的[pump]键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。按A泵的[pump]键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。5.2.2检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。5.2.3观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按4.6操作。5.2.4观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。6、进样6.1进样前在CS-LightRealTimeAnalysis中:(1)点击“单次分析”，接着点击“样品记录”，在样品记录名称中输入所要检测得样品名称，然后点击“数据文件”选择该样品储存在哪里，最后在“数据储存的文件夹”后面输入该样品名称，点击确定。(2)在信号采集菜单中设定停止时间和延迟时间。6.2进样前按检测器[zero]键调零，按软件中[零点校正]按钮校正基线零点，再按一下[查看基线]按钮使其弹起。6.3用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取20L。7、数据处理7.1在桌面双击“CS-LightPostrumAnalysis”，点击确定按钮后，在“文件夹目录中”选中该样品记录双击鼠标，在谱图上单击鼠标右键的“显示设置”，在“显示设置”中选择“展开色谱”的“时间”“0”到“20”后点击确定7.2用鼠标点击“编辑”选择“积分”中的“最小峰面积/高”输入“最小峰面积值”，然后又点击“定量”在“定量方法”中选择“面积归一法”，然后点击查看。7.3复制谱图到Word文档，在谱图中点击鼠标右键选择“复制”；复制数据，单击鼠标左键全选，然后鼠标右键“复制表格到剪贴板（b）”。8、关闭仪器分析完毕后，关闭色谱工作站，再自上而下关闭仪器。【数据记录与分析讨论】磺胺嘧啶谱图0.05.010.015.020.0min0.01.02.03.04.05.06.07.08.0μV(x100,000)050100150200250300350400℃峰号保留时间面积面积%峰高19.03912591994.5100.0000501938.0混合样谱图0.05.010.015.020.0min0.01.02.03.04.05.06.07.08.0μV(x100,000)050100150200250300350400℃峰号保留时间面积面积%峰高18.9635190936.845.3724251662.7210.0876249787.554.6276300993.2实验结果分析讨论：本实验所检测样品为已知样品磺胺嘧啶、磺胺吡啶标准溶液及磺胺嘧啶-磺胺吡啶混合液，实验中采用进一单一标准样品，得到其谱图后再对混合样品液进行检测，根据保留时间做定性分析，从而确定另一待测物的谱峰。在定性分析后，由于本实验中待测物只有两种，且样品液能保证待测物均能出峰，故定量分析采用简便，准确，操作条件对结果影响较小面积归一化法（此方法在实验四中曾被运用）。定性分析：查阅资料可得，磺胺嘧啶及磺胺吡啶两者的结构如下：磺胺嘧啶磺胺吡啶实验中，流动相A为0.05%的甲酸溶液，流动相B为乙腈，两者之比是：83:17。实验开始时首先进样的样品为磺胺嘧啶单样，因此得到磺胺嘧啶单样的谱图，其保留时间为9.039min；第二次进样的是混合样品，所得谱图出项两个谱峰，出峰时间分别为8.693min和10.087min。根据第一次进样所得的磺胺嘧啶的保留时间可判断，在混合样品谱图出现的两个谱峰中，第一个应为磺胺嘧啶的峰，第二个为磺胺吡啶的色谱峰，即磺胺吡啶保留时间为10.087min。从实验结果中可以看到，磺胺嘧啶在前后两个谱图中所得到的保留时间并不是完全一致，此现象很可能是因实验人员操作过程中出现少许偏差。而从第二个谱图中我们看到，两待测物所得到的色谱峰相当接近，保留时间差仅为一分钟左右，若当某待测物在单样谱图和混合样谱图所得的保留时间出现了较大偏差（就如上述提到的磺胺嘧啶出现的小小偏差），而两种待测物之间保留时间又相差很小的情况下，该定性分析就会面临做出准确判断的局面。所以，应对该实验条件进行少许改进，通过改变流动相比例等实现使得待测物达到很好的分离效果。定量分析：（面积归一化法）由定性分析实验结果我们知道，在混合样品溶液中磺胺嘧啶与磺胺吡啶所占比例为别为45%:55%，即两者浓度比为9：11。【思考题】1、高效液相色谱法用于有机农药残留分析中的应用的发展前景如何？答：高效液相色谱用于农药及其残留物的分析有其独特优势,如何快速、准确地进行农药残留特别是多种残留成分的分析测定,是农药残留分析亟待解决的问题。随着科学技术的发展,分析手段与方法得到不断改进和提高,高效液相色谱技术也在不断发展,例如,引入3μm填料的色谱柱及能分离几何异构体和光学异构体的手性柱。在检测方法方面有液相色谱-质谱联用技术、光电极组合检测器以及液相色谱法与原子吸收光谱的联用。后者可以测定以砷、铅及汞等有机金属化合物形式存在的污染物。含有毒金属的不同结构有机化合物具有明显不同的毒性,单一测定无机元素总含量不能真实地反映其毒性程度。同时还有报道用直接光谱分析,毛细管区带电泳来检测农药的。随着计算机的普及,实验室自动化检测以及在线快速检测技术也得到了较快的发展。【实验结论】高效液相色谱法能快速、准确地进行农药残留成分的分析测定，在本实验中对磺胺嘧啶及磺胺吡啶进行了定性定量测定分析，得到较好的结果。【参考文献】[1]朱正斌.高效液相色谱法在农药残留分析中的应用.化学工业与工程技术，Dec.,2004:Vol.25No.6