搜索
专题1基因工程基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。科技探索之路基础理论和技术的发展催生了基因工程20世纪中叶，基础理论取得了重大突破●DNA是遗传物质的证明1944年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。●DNA双螺旋结构和中心法则的确立1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。1958年，梅塞尔松和斯塔尔用实验证明DNA的半保留复制。随后不久确立的中心法则，解开了DNA复制、转录和翻译过程之谜，阐明了遗传信息流动的方向。●遗传密码的破译1963年，尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码。1966年，霍拉纳用实验证实了尼伦伯格提出的遗传密码的存在。这些成果不仅使人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。公众号：汉水丑生，专注于生物高考和教学技术发明使基因工程的实施成为可能●基因转移载体的发现1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具。●工具酶的发现1970年，阿尔伯、内森斯，史密斯在细菌中发现了第一个限制性内切酶（简称限制酶）后，20世纪70年代初相继发现了多种限制酶和连接酶，以及逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。●DNA合成和测序技术的发明自1965年，桑格发明氨基酸序列分析技术后，1977年，科学家又发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能，之后，DNA合成仪的问世又为引物、探针和小分子量DNA基因的获得提供了方便。●DNA体外重组的实现1972年伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。重组DNA表达实验的成功1973年，博耶和科恩选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。这个实验证明了①质粒不仅可以作为基因工程的载体，②重组DNA还可以进入受体细胞，③外源基因可以在原核细胞中成功表达，并实现物种之间的基因交流。至此，基因工程正式问世。第一例转基因动物问世1980年，科学家首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因小鼠。1983年，科学家又采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展阶段。PCR故术的发明基因工程问世后，1988年由穆里斯发明的PCR技术，使基因工程技术得到了进一步发展和完善。21.1DNA重组技术的基本工具我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉的培育，首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后，导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。限制性核酸内切酶——“分子手术刀”切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，例如，EcoRI、SmaI限制酶识别的序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式—黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。寻根问底：根据你所掌握的知识，你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵。限制酶就是细菌的一种防御性工具，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。生物技术资料卡：限制酶的命名用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪个生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichiacoli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一个限制酶，则进一步表示成EcoRI。DNA连接酶——“分子缝合针”将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coliDNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。寻根问底：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？提示：（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。旁栏思考：想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等。基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞中。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。公众号：汉水丑生，专注于生物高考和教学在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。2.联系你已有的知识，想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?提示：生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？提示：自然存在的质粒DNA分子并不完全具备作为运载体的条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。31.2基因工程的基本操作程序求异思维：你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？提示：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。目的基因的获取获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。目的基因主要是指编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库。也有一些基因文库比较小，就像某个市或某个单位的图书馆，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？这还是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。►寻根问底：为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得。也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。生物技术资料卡：基因文库的构建将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。公众号：汉水丑生，专注于生物高考和教学文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以利用PCR技术扩增目的基因PCR是多聚酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时4间内大量扩增目的基因。PCR的原理和做法并不难，它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n,其中n为扩增循环的次数)。上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。此外，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。寻根问底：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简单吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化