植物发育生物学3

第三章植物细胞编程死亡及其与发育的关系PCD的概念PCD的特征及其与坏死的比较检测PCD的方法PCD的机理植物PCD的特点PCD在植物发育中的作用•细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)是一个由基因决定的细胞主动的有序的死亡方式，是由某些特定基因参与调控的，在细胞生长发育以及对外界刺激的反应过程中有关键作用的一种重要生物学过程。如胚乳细胞去核之后，细胞并未立即死亡，继续进行淀粉和贮藏蛋白的合成与积累，最终被贮藏物质充满时成为死细胞，完成其程序性死亡过程。一、PCD的概念•编程性细胞死亡（ProgrammedCelldeath，PCD）的概念由Gluchsman在1951年首先提出。•1965年Lockshio首次提出PCD是多细胞动物组织中细胞对特定生理性刺激产生反应的死亡方式。•1972年，Kerr提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念。由于PCD和凋亡时细胞表现相同的形态特征，因此人们认为细胞凋亡就是PCD。其实凋亡是PCD过程中伴随着出现的特定的形态、生化特征，也有一些细胞在PCD过程中并不表现凋亡的特征。可见，凋亡是PCD在形态学上的表现，两者不完全等同。PCD在植物体整个生长发育过程中普遍存在。植物体在胚胎发育、根、茎、叶、花等器官的形态建成、细胞增殖分化过程中，都伴随有PCD的发生。营养生长中的PCD现象糊粉层细胞的退化消失根冠细胞的死亡导管分子的形成叶片的形成与衰老生殖生长中的PCD现象大小孢子的形成与发育雌、雄配子体的发育胚的发育单性花的形成二、PCD的特征及其与坏死的比较细胞核凝聚成块状、马蹄状，凋亡小体以出芽形式使细胞外观呈葡萄状改变。形态：细胞水分减少导致细胞萎缩，细胞分成一块块，后被吞噬。结构：核增大，色素积累，细胞质向外出芽，染色质固缩。功能：新陈代谢速度减慢，呼吸速度减慢（线粒体功能退化、形变）有些酶的活性降低（酪氨酸酶）细胞膜通透性功能改变。PCD细胞的主要特征PCD的生化特征：caspase的出现和DNA的降解。细胞核：染色质DNA被断裂成分子量较大的染色质DNA片段。断裂的染色质DNA被依赖于Ca2+、Mg2+的DNA酶Ⅰ内切成180-200bp及不同倍数的片段。蛋白质：在PCD中有生物大分子的合成。离子：细胞内Ca2+增加，打开钙通道，开始凋亡过程。Zn2+是核酸酶的抑制剂，阻止凋亡。细胞骨架：去掉微管，可导致凋亡，而微丝对凋亡是必需的。PCDnecrosis概念单细胞性、细胞质细胞核凝缩、核断裂、质膜出芽、凋亡小体形成的细胞死亡非单细胞性，具质膜丧失完整性和电化学梯度特征，有炎性渗出物外泄的细胞死亡形态结构细胞皱缩，胞质凝集，膜出芽，膜完整性逐步丧失。线粒体等胞器稳定性高，染色质在核膜下半膜状聚集，凋亡小体形成细胞肿胀，胞质溶解释放，膜起泡，泡内不含胞器，膜完整性丧失。染色质呈絮状，无凋亡小体形成。生理生化核酸内切酶作用，DNA降解成180-200bp片段，发生单细胞死亡被临近细胞或巨噬细胞吞噬，有DNA梯形成溶酶体酶作用，DNA随机断裂，发生迟，细胞群体死亡，有炎性渗出物，引起临近组织炎症反应，无DNA梯形成刺激生理或病理性，有基因调控病理性，不需基因调节细胞编程性死亡（PCD）与坏死（necrosis）比较：PCD的过程通过秀丽隐杆线虫的研究发现，其细胞凋亡明显划分为四个阶段：（1）细胞命运的选择阶段即细胞死亡的决定阶段；（2）细胞死亡的执行阶段；（3）死亡细胞被吞噬阶段和（4）死亡细胞的降解清除阶段。植物细胞凋亡也可能存在类似的上述四个阶段，但这四个阶段分别由哪些基因共同执行有待进一步深入研究。PCD的研究方法很多，目前主要采用的有形态学观察法、电泳法、末端标记法以及流式细胞光度术等。三、检测PCD的方法1.形态学观察法包括透射电镜观察超薄切片和石蜡切片染色法。电镜下可看到细胞核趋边化、凝集化，染色质趋边化区域的双层核膜界限模糊；正常细胞的核物质呈均匀分布。DAPI染色的正常（1，2）和乙烯诱导的发生PCD的（3，4）胡萝卜细胞原生质体细胞色素c诱导的胡萝卜细胞原生质体PCD中DAPI染色结果:a,b为对照DAPI荧光观察结果4月中旬杜仲顶芽衰老DAPI荧光显示各部分细胞核变化：a—顶芽b—顶端分生组织c—幼叶DAPI荧光观察结果图II.8d-f.5月中旬杜仲顶芽衰老DAPI荧光显示各部分细胞核变化：d—顶芽e—顶端分生组织f—幼叶DAPI荧光观察结果6月中旬杜仲顶芽衰老DAPI荧光显示各部分细胞核变化：g—顶芽h—顶端分生组织i—周围分生组织a,d,g:标尺为20µm其余标尺为10µma:4月b:5月4月叶：叶肉细胞核成球形，染色质分布均匀。5月叶：细胞核形态无变化，细胞体积增大。Bar=20µm(a1-e1)Bar=5µm(a2-e2)杜仲叶片衰老过程中叶肉细胞核的变化c:9月d:10月9月叶：细胞核开始轻微皱缩。10月叶：细胞核皱缩加剧。2.DNAladder检测发生PCD的细胞染色质DNA在核小体间断裂成180-200bp及其倍数的片段。因此在琼脂糖凝胶上能得到DNAladder图谱。这是PCD最重要的特征之一，常作为PCD的特异性生化指标而被广泛应用。若将DNA断片用放射性核素标记，电泳后进行放射自显影，则可使灵敏度提高50-100倍。Cytc诱导的胡萝卜细胞PCD中DNA电泳1：4月完整DNA2：5月，6月较完整DNA3：7月，8月小分子量DNA出现4：9月DNALadder较明显5：10月DNALadder明显6：11月smear杜仲叶片衰老中形成的DNALadder3.原位末端标记用常规石蜡切片即可进行，其原理是核DNA断裂后产生3’-羟基末端，DNA聚合酶Ｉ可将Biotin-11-dUTP标记到3’-羟基末端上，该生物素通过与亲和素的特异性结合使HRP-Avidin（辣根过氧化物酶标记的亲和素）结合在DNA断点部位，加入DAB显色液后，在原位出现黄褐色沉淀。a:4月b:5月c:8月d:9月e:10月f:11月杜仲叶片衰老中DNAcleavage4.流式细胞光度计可进行植物细胞核DNA含量的测定，PCD时，DNA发生断裂，用流式细胞光度计检测，在DNA直方图上出现亚二倍体核型峰，此法操作简单，精确度高。5.彗星电泳彗星电泳（cometassay）是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，在电场中进行短时间电泳，再用荧光染料染色，PCD细胞中形成的降解的DNA片段，在电场中泳动的速度较快，使细胞核呈现出彗星状的图案，而正常的未发生DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这也是一种简便的PCD检测法。VK3诱导的烟草原生质体经微凝胶电泳后DAPI染色的荧光图谱6.Caspase检测Caspase在PCD过程中起着关键作用的一个酶家族，通过对其家族成员的检测也可确定是否发生PCD。杜仲分化中木质部的Westernblotting:7.钙结合蛋白AnnexinV检测•此方法检测PCD的设计原理是，很多类型的PCD开始时，原先位于细胞膜内表面的一种膜磷脂－磷酸酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）转位到细胞膜的外表面，此过程就称作PS外化（externalization）。因为AnnexinV对PS具有很高的亲和性，PS一旦出现于细胞膜外表面就很容易与AnnexinV结合而被标记。在PCD过程中，PCD因子诱导1小时后就发生了PS外化，早于细胞核变化的发生，因此这是一种早期检测PCD的方法。•线虫成体有1090个细胞，发育过程中131个细胞发生PCD，有11个基因与PCD有关。•3个基因（ced3、ced4和ced9）与PCD的开始有关。•7个基因（ced1,ced2,ced5,ced6,ced7,ced8和ced10）控制相邻细胞吞噬死细胞。Nuc-1基因负责被吞噬细胞DNA的消化。•Ces-1,Ces-2,egl-1决定细胞是否进入死亡程序。四、PCD的机理（1）启动阶段（前线粒体阶段）启动细胞内死亡程序的死亡信号的产生和传递过程。包括：TNFR——死亡受体的活化、DNA损伤应激信号的产生、存活信号的产生、DNA损伤导致抑癌蛋白P53的活化、Bcl-2家族蛋白对编程死亡信号的调节。PCD的机理：（2）效应阶段（线粒体阶段）•主要是PCD的中心环节—Caspase的活化。•Caspase激活的机理——“紧密接触”学说。•其次还涉及线粒体通透性改变。（3）清除阶段（后线粒体阶段）•包括caspase对死亡底物的酶解•染色体DNA片段化•吞噬细胞对凋亡小体的吞噬1、植物PCD与动物的PCD相同之处具有动物PCD的形态特征。分为两类：•植物体发育过程中必不可少的一部分。•植物体对外界环境，包括对病原体的一种防御性反应。五、植物PCD的特点2、植物PCD与动物PCD的不同之处•细胞死亡后产物的去向•死亡诱导因子1、在生殖器官发育中保证功能细胞的发育和生殖过程的完成（1）植物茎端分生组织由营养生长转化为生殖生长后，顶端原始细胞的分化（2）雌雄异花和雌雄异株植物的性别决定（3）保证功能孢子的形成和发育（4）保证配子体的发育（5）传粉的花粉管生长和受精后失去功能花结构的衰老退化。六、PCD在植物发育中的作用豌豆由营养芽向花芽的转化2.在胚胎发育中保证受精卵发育成正常胚胎•植物传粉后，助细胞和反足细胞退化•无胚乳种子胚发育中胚乳细胞发生PCD3.在种子萌发中保证幼苗的形成•有胚乳种子萌发中糊粉层细胞的变化是PCD•种子萌发过程中胚乳细胞和无胚乳种子的子叶贮藏细胞的PCD•种子和果实成熟时，其种皮细胞死亡具有PCD胚乳细胞的解体4.在植物体发育中保证有关器官的建成和组织分化（1）叶的形态建成和脱落（2）输导组织和机械组织的形成（3）次生保护组织的形成（4）根生长过程中根冠表面细胞的死亡过程5.在免疫反应和抗病中的作用当病原体侵染植物时，植物发生过敏反应，其间与病原体接触的细胞就发生PCD。