基因敲除小鼠的实验流程

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提取基因组DNA基本实验流程获取鼠尾组织PCR扩增琼脂糖凝胶电泳成像分析一、动物基因组DNA的提取实验原理真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。获取鼠尾组织每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml),55度水浴过夜,至鼠尾溶解。提DNA步骤:1.每管鼠尾加入300ul饱和NaCl,充分混匀,12500rpm离心20min2.取上清700ul至新的离心管中,加入预冷的异丙醇700ul,上下颠倒混匀,动作轻柔,直至看到絮状DNA析出为止,12500rpm离心20min,弃上清3.加入800ul75%乙醇于离心管中,洗沉淀,12500rpm离心10min4.晾干沉淀,加入100ul的PCR级的水。二、PCR扩增变变变变变变90变95变40变60变70变75变cycle25~30次循环后,模板DNA的含量可以放大100万倍以上。动画PCR:(20ul体系)2xMix10ul无菌水2ul2pmol引物12ul2pmol引物22ul2pmol引物32ul模板DNA2ulPCR扩增仪95℃3min95℃30sec60℃30sec72℃30sec72℃5min35cycles三、琼脂糖凝胶电泳原理:在pH8.0~8.3的缓冲液中,核酸分子带负电荷,向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同,因此在自由泳动时,各种核酸分子的迁移率相似,无法分开。然而,在浓度适当的凝胶中,由于分子筛效应,使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异,从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度,与分子的碱基组成及电泳温度(4℃~30℃之间)无明显关系。一般说,同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比,与电场强度(小于5V/cm)成正比。琼脂糖凝胶电泳

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