草莓组织培养研究进展

草莓组织培养研究进展[摘要]从草莓组织培养类型（草莓茎尖组织培养、草莓花药培养、草莓叶片、叶柄组织培养）开始，介绍了近几十年国内外草莓组培的研究现状和进展。[关键词]草莓;组织培养;草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是世界上七大水果之一，素有“水果皇后”的美称。草莓果实色泽艳丽，芳香多汁，酸甜适度，鲜美可口，营养丰富，每百克果实内含有蛋白质1g，脂肪0.6g，糖4～12g，酸0.8～2g，无机盐0.6g，粗纤维1.5g，Vc45～120mg，比苹果和葡萄高10多倍，并含有丰富的磷、钙、铁、锌等矿物质，其中锌的含量是香蕉的4倍以上，比柑橘高6倍以上，比苹果高40倍以上。另外食用草莓对肠胃病和贫血病有一定的疗效，对促进智力发育有重要作用。深受国内外消费者的喜爱。草莓作为一种栽培周期短、结果早、见效快的经济作物，近15年来在我国发展迅猛，中国园艺学会草莓分会统计2003年底，我国草莓总面积和总产量均跃居世界第一位。在浆果中，草莓的总产量和总面积仅次于葡萄，成为我国发展农村经济，促进农民增收的重要经济作物。随着草莓在国内栽培面积的扩大和种植年限的延长，草莓的病毒病严重影响草莓的生产。作为高级浆果的草莓，在我国目前的生产栽培上多沿用无性繁殖种苗：主要方法是匍匐茎繁殖和分株繁殖，但这两种方法效率低、种苗易退化、易造成病毒蔓延。王国平（1988）等调查，我国栽培草莓带病毒植株率过80%以上，戴子林（1995）等调查，我国长江流域感染大面积植株感染率在50%以上；感染了病毒病的草莓果子一年比一年小、畸形、品质差、生长缓慢，一般减产30%-80%，并逐年加重；严重影响草莓的长势、品质和产量，对病毒病目前还没有药剂可以防治。通过草莓组织培养扩繁草莓脱毒苗，可以解决上述问题。近年来在草莓种苗生产中，有关草莓组培快繁技术的研究备受人们的重视，本文就草莓组织培养研究与应用作一综述。一、常见草莓组织培养类型目前，国内外在草莓品种快速繁殖上已有不少报道：常用的外植体主要有：茎尖（Adam，1972；庆子孝，1972；谭兰英等，1981）、腋芽（Boxus，1974、1977；杨乃博，1981）、叶片、叶柄、茎段，花药（Quak,1977；大泽，1972）。常见的草莓组织培养主要的类型：草莓茎尖组织培养、草莓叶片和叶柄组织培养、草莓茎段组织培养、草莓花药培养。其中，草莓在繁殖脱毒苗选择外植体主要是茎尖和花药；组织苗叶片和叶柄是进行组织培养，有取材方便、便于保存和携带的优点。草莓茎段使用较少。1．草莓茎尖组织培养草莓茎尖组织培养的主要目的，在短时期内加速繁殖优良品种，脱除感染病毒的草莓品种。茎尖组织培养程序一般可分为四个阶段：（1）外植体的准备；从田间采取供试草莓品种茎尖,用自来水将其冲洗干净，用纱布轻轻擦干，然后在超净工作台上，按程序消毒。（2）茎尖苗的诱导和增殖培养；取茎尖和匍匐茎顶端生长点,在MS培养基成活2-3周,再接种到附加不同浓度激素的MS中进行扩繁增殖试验。茎尖外植体的脱毒率与所取茎尖大小有直接关系，外植体越小，脱毒率越高，但相对成活率越低，且很难操作。,王长芸等(2007)不超过0.2㎜的茎尖脱毒率100%,0.3-0.4㎜的茎尖脱毒率84.5%以上,1㎜以上的茎尖脱毒率极低。一般取0.2-0.4㎜为宜,在这个范围内脱毒率较高操作比较容易。（3）生根培养；将材料接种促进生根的培养基上生根成苗。（4）小苗的移植驯化。移栽前将瓶苗提前1～2d放在自然温度下，让组培苗在自然环境下适应一段时间。边启盖边将苗子根部琼脂洗净，栽入由土、沙、珍珠岩2:1:1配制好的苗床中，湿度保持70～80%，用膜覆盖3～5d，温度20℃～25℃和光照以55%～70%自然光为宜，成活率可达90%左右。这四个阶段并不是一成不变的，邓明琴等（1983）草莓茎尖试验无根苗外生根试验表明。以珍珠岩作基质的生根成苗率达86.7-100%移栽成活率也较高.育苗周期缩短20天,繁殖生根可以扩大规模，节省人力,财力,降低成本。草莓茎尖组织培养过程中不需要形成愈伤组织和再分化过程,培养时间短,变异率低.但在分生组织培养中培养材料易感染,消毒难,茎尖培养操作繁琐。2．草莓花药培养草莓花药培养在上世纪70-80年代发展很慢，到1971年仍停留在愈伤组织阶段。直到20世纪80年代，国内外仅有两例经花药培养获得单倍体植株的报道，即国内薛光荣等通过改变培养基成分等措施，培养东方草莓的花药，首次成功得到单倍体植。Nicmirowica-Szczytt等利用激动素代替BA，从八倍体“Redgauntlet”品种获得了15个单倍植株，但未存活到成熟。之后，OosawaandTakayanagi(1982)，VelchevandMilanov对不同品种进行了培养，所获得植株仍为正常八倍体。草莓花药培养意义不断扩大。草莓花药培养方法：（1）材料准备与消毒，采用花粉发育至单核靠边期的花药，通常花粉单核靠边期的草莓花蕾形态是:花蕾未开放，花蕾略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色或者淡绿且不松动，花药微黄而充实。张慧琴等（2006）认为，花药培养时，花粉在接种时所处的发育时期可能比培养基更为重要。将采取的新鲜花药放在2-4℃的低温中预处理2-3天，进行预处理。自来水将经过预处理花药冲洗干净，用纱布轻轻擦干，然后在超净工作台上，按程序消毒。（2）草莓花培诱导和绿苗分化，将剥落的花药接种到分化培养基上，MS培养基为基本培养基，添加一定浓度的诱导分化激素组合。培养基中，徐振南与万蜀渊证实，较高的[NO3-]／［ＮH4］比有利于草毒花药培养中愈伤组织的产生。无机成分中铁对多种植物花药培养中愈伤组织的产生有重要影响，鳌合铁被认为是必须的。另外，培养基中的有机成分对愈伤组织的诱导同样具有重要作用。另外，蔗糖浓度在花药培养诱导单倍体植株过程中起重要作用。较高的蔗糖浓度可以提高花药培养效率。徐振南研究蔗糖、乳糖、甘油、葡萄糖在草毒花药培养中的作用，认为3.0-5.0%的乳糖效果明显优于蔗糖。而Owen等研究了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖3种碳源，结果表明葡萄糖效果最好。（3）花培增芽带培养和花药植株生根，若分化出来的丛芽太小，则将丛生芽切成小块，接种到增殖培养基，继代扩繁一次。生长健壮的无根苗接种生根培养基上诱导生根。(4)炼苗、移栽与扩繁，移栽前将瓶苗提前3d放在自然温度下，取出小苗，洗去根部残留培养基移到用高压灭菌锅消过毒的蛙石和腐殖土等量的基质中，喷施0.1％的多菌灵溶液，炼苗１周即可移栽。移栽时，适温、高湿是移栽成活的关键再结合沙培移栽，成活率一般在90％以上。要进行保湿，每天喷水２次，一周后揭膜。草莓花药培养中，花药外植体接种操作起来比较简单，容易消毒，脱毒率可以达到100%，可以免去病毒检测，具有广泛的适用性，但从花药培养到分化出再生苗需要时间较长，因为花药培养首先要经过愈伤组织的诱导和再分化过程，然后才能转人正常的继代快繁培养过程。3．草莓叶片、叶柄组织培养叶片和叶柄是草莓基因转导中常用的外植体，在草莓组织培养中取材最为方便，便于携带和保存。草莓叶片、叶柄组织培养方法：（1）取材，取草莓健壮叶柄（约2㎝）和青嫩叶片，按程序消毒。另外，也可直接取组织苗的健壮叶柄、叶片为接种材料。采外植体时的最佳时期是6-7月份，此期间外界的条件最适合草莓生长发育，外植体生命力强，再生效果好。错过了最佳时间，外植体的生命力下降，可能会影响愈伤的发生率。（2）诱导愈伤，取叶柄切成5㎜的小段，叶片切成直径4㎜的圆盘，或取20～30d叶龄的组培苗,弃去叶缘和叶尖,切成02cm×02cm小块接种于诱导愈伤培养基中。宋国庆等（2000）认为，同一基因型的同一组织或器官再生能力还受培养苦放置方式的影响，叶背面接触培养基时的再生能力，显著高于叶面接触培养基。张红梅，王俊丽（2003）认为，诱导叶盘再生不定芽的最佳外植体培养基为MS+6-BA（1.5mg/l）+IAA(1.5mg/l)。（3）诱导生根，芽形成植株后，将生长健壮的无根苗接种生根培养基上诱导生根。（4）驯化移栽，前须先炼苗2-3天，然后洗去根部培养基、剪去老叶、栽入经过消毒和洗涤的腐殖土-蛭石-珍珠粉（1：1：1）为基质的育苗钵中，盖膜、适时浇水，置于散射光下培养，成活率达80-90%。艾勇等（2000）认为也可把苗直接栽入消毒过的苗床上，浇足水盖上塑料膜，遮荫不遮光，每天喷少量雾水，湿度保持80%-90%，周后逐步降低湿度，2周后揭膜。4周后成苗率一般达85%以上。草莓叶片组织培养不仅可以作为快繁和研究器官建成的一项重要途径，更重要是的是对于体细胞诱变育种和和基因转化等有重要的意义。但目前我国大部分草莓品种叶片再生率低,只有少数几个品种获得了简单、高效的叶片再生芽系统。需要更进一步的研究。二、草莓组织培养影响因子（1）消毒剂与消毒时间草莓组织培养中常用的灭菌剂的种类很多，常用的有次氯酸钠溶液（含有效氯0.4%-0.5%）、过氧化氢10%-12%水溶液、升汞0.1%水溶液。其中前两种灭菌剂对接种材料比较安全，但灭菌时间较长，常使接种材料外层氧化变褐，且灭菌效果不如升汞。升汞有很强的杀菌能力，但浸泡时间稍长，会造成接种材料中毒。因此，材料消毒处理时间不能过长，时间短根本不能杀灭细菌，灭菌10min后，大部分分生组织褐化严重，因此草莓组织培养用升汞0.1水溶液消毒处理8min-10min最好，且处理后一定要用无菌水充分清洗。（2）激素及附加成份1．激素对于草莓叶片组织培养而言,一旦外植体确定,影响其再生效果的最关键因素即为激素。在有关文献报道中,绝大多数都有激素方面的研究。不同品种对激素种类及浓度要求不同。同时，大量试验结果证明，花药离体培养过程中，各生长调节物质的配比及含量对愈伤组织的产生具有重要的影响作用。它们的组成与配比不但显著的影响着出愈率，而且对愈伤也有重要的调控作用。草莓花药培养中附加一定量的生长素和细胞分裂素对愈伤组织的诱导是必需的。马洪民和高公泓的试验，于培养基中仅附加NAA时，花药不能被诱导产生愈伤组织，而以IAA和BA相配合则可诱导出愈伤组织。Margaret等也证实，合理的NAA与KT配比对愈伤组织的诱导是不可或缺的。大泽胜次以不同激素配比的培养基培养草莓花药，在附加NAA和BA的培养基上培养2－3周后得到了颗粒状的黄绿色愈伤组织。2．附加成分，附加成份是指在含有一定激素配比的培养基中添加的某些营养物质(如水解酪蛋白、谷氨酞胺等)、吸收物质(如活性炭等)及抗氧化物质(如AgNO3，Vc等)等外源添加物。这些附加成份也在草莓组织培养中有着重要的作用。（3）培养方式与环境草莓花药、茎尖、叶片和叶柄等组织培养一般采用琼脂固化培养法。光照与培养温度对草莓组织培养的影响很大。光质对植株再生有不同的影响，往往光合的作用光谱对再生作用最有效，在试验室培养过程中最常用的是白色荧光。秦永华等对草莓叶片离体再生研究发现，不同滤光膜对草莓不定芽的分化有显著效应，绿膜和红膜对芽的分化有明显促进作用。草莓花药培养前期采用暗培养，直接光照培养均有报道。而Owen等研究表明先暗培养30d然后在白色荧光下培养30d比直接在黄光或白色荧光下培养的芽诱导率要高很多。但适合单倍体诱导的光质和光量尚需要进一步研究。草毒花药培养温度一般都控制在25℃左右，笔者曾采用20℃和25℃两种温度诱导了花药愈伤组织形成，结果表明20℃诱导的愈伤组织结构紧密，颜色绿，活力强，易分化。三、结语其它方面，草莓组织培养的研究与应用也有着重要的作用，是一条非常有价值的保存种质资源的途径，采用组织培养将种质保存在试管内，可以较小的空间内有效的保存大量的种质资源，而且能很快恢复繁殖，免遭病虫危害，有得于种质交换等优势。但在用植物细胞大量培养的研究还有很多关健性的问题没有得到根本性解决，始终制约着植物组织培养实现工业化生产的进程。因此，对于草莓组织培养规模放大的研究和利用范围的推广仍然是一项十分有意义而又艰巨的研究任务。参考文献：[1]牛红云，王荃，薛贵彬，等.草莓（FragariaananassaDuch）茎段组织培养的研究[J].