大肠杆菌细胞DNA复制、修复和重组途径的衔接

大肠杆菌细胞DNA复制、修复和重组途径的衔接*邱洁芳潘学峰**(北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081)摘要以大肠杆菌为例围绕相关领域的研究动态进行分析和总结．DNA复制、损伤修复和重组过程的相互作用关系研究是当今生命科学研究的前沿和热点之一．越来越多的研究表明，在分子水平上，DNA复制、损伤修复和重组过程既彼此独立，又相互依存．上述途径可以通过许多关键蛋白质之间的相互作用加以协调和整合，并籍此使遗传物质DNA得到有效的维护和忠实的传递．需要指出的是，基于许多细胞内关键蛋白及其功能在生物界中普遍保守性的事实，相信来自大肠杆菌有关DNA复制、修复和重组之间的研究成果也会对相关真核生物的研究提供借鉴．关键词DNA复制，损伤修复，重组学科分类号Q291/Q75*北京理工大学自然科学基金资助项目.**通讯联系人.Tel:[phone]E-mail:[e-mail],[e-mail]收稿日期：2008-01-26，接受日期：2008-04-15生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics2008,35(7):751~756的复制(replication)、损伤修复(damagerepair)和重组(recombination)等．习惯上，这些过程被称为3R过程．其中，DNA复制可以使遗传信息携带者DNA得到忠实的倍增，而DNA损伤修复则会在一定程度上保证遗传实体尽可能稳定．对于基因重组而言情况则相对复杂，既可以作为辅助手段参与DNA复制，同时也参与某些类型DNA损伤的修复，以及负责遗传物质进化过程中的重新排列和组合．越来越多的研究结果表明，DNA的复制、损伤修复和重组过程之间既相对独立，也存在着密切的联系．比如，参与DNA复制的DNA聚合酶也参与DNA损伤修复和重组过程．大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶玉既在DNA的复制过程中起作用(冈崎片段5忆的切除修复)也在DNA损伤修复中发挥作用[1]．此外，细胞内存在的主要DNA损伤修复机制均与DNA复制、转录相耦联，可能DNA复制或转录过程中某些DNA损伤更容易在瞬间出现的裸露DNA链上被DNA损伤修复蛋白加以识别[2]．DNA重组除了参与正常细胞增殖过程外(在减数分裂时负责染色体交叉互换的拆分)，同时，也主要参与了修复DNA单链空缺和DNA双链断裂损伤，是一种重要的修复机制———重组修复．细胞在逆境状态或一些与正常DNA合成途径相关的突变体中，会采用同源重组依赖的DNA复制等．1DNA复制、损伤修复和重组的组织原则1.1基于DNA单链空缺大小限制的空间调控方式在DNA新陈代谢过程中，体内作为中间产物的DNA构象类型是有限的[3～5]．目前在DNA的复制、损伤修复和重组工作模型中，最常用的3种DNA构象分别是DNA复制叉、DNA单链空缺和DNA双链断裂．对于不同的DNA单链空缺而言，其彼此之间的区别标志主要在于缺口的大小．例如，DNA后随链复制过程是以一个岗崎片段为单位进行的．在这个过程中，已经合成的冈崎片段和刚刚起始复制的冈崎片段之间就是一个典型的单链空缺，其平均长度为几百个碱基．与此类似，在碱基错配对修复过程中可以制造出含有1000个碱基左右的空缺．但在碱基或核苷酸切除修复时出现的DNA单链空缺则较小，分别为1～8bp和1～30bp.现有的发现表明，单链DNA空缺往往是DNA3R过程的重要场所．但3R过程中的不同蛋白质组分所能识别的单链空缺大小彼此不尽相同．比如，RecA蛋白是大肠杆菌同源重组过程的第一生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2008;35(7)名称序列特征序列构象H-DNA结构镜象重复序列AAGAGGGGAGAATTCTCCCCTCTTG-DNA四链结构寡聚(G)n序列AG3(T2AG3)3单链DNA发卡结构同向重复序列TCGGTTCGGTAGCCAAGCCADNA十字形结构反向重复序列TCGGTACCGAAGCCATGGCTZ型DNA(YR·YR)nCGCGTGCGTGTGCGCACGCACA1.2基于蛋白质间相互作用的有效调控方式遗传信息的表达和维护包含许多生化步骤，靠单一的蛋白质是无法完成的，所以DNA的复制、损伤修复和重组过程涉及蛋白质间相互作用并常以蛋白质复合体的形式执行功能，同时通过蛋白质的组装与去组装达到各途径的协调控制．1.2.1DNA修复与复制．大肠杆菌的错配修复所拥有的蛋白质组分包括MutS、MutL、MutH、Dam等专用蛋白质以及外切核酸酶和相应的DNA螺旋酶．真核生物细胞中也有类似的蛋白质组分，如MSH1-6是MutS的同源蛋白．最近已有研究表明，DNA复制过程中的PCNA会与MSH2·MSH3和MSH2·MSH6蛋白质复合物相互作用，暗示PCNA可能参与错配修复的识别[16]．大肠杆菌的MutS、MutL也能与聚合酶芋的茁亚基相互作用(图1，图2)．MutS上有两个区域可以与茁亚基结合，一个接近C端，一个靠近N端．MutL则通过其ATP结合位点附近的一个环状结构与茁亚基结合．三者间的相互作用使DNA聚合酶芋的核心酶离开，UvrD及外切核Table1Non鄄BDNAconformations[15]表1DNA非B型构象[15]B-ZJumctions个蛋白质，但RecA起始要求单链空缺需含70bp以上．因此，这在一定程度上限制了在较短的DNA单链空缺区域发生同源重组．因此，在碱基或核苷酸切除修复过程中，往往采取利用DNA复制对修复过程中产生的单链空缺进行填充，而不大可能会借助同源重组进行修复．但是，一旦单链缺口足够大，比如被干扰的DNA复制叉所留下的单链缺口，或者在DNA错配修复时产生的缺口等，由于它们往往含有几百到上千个核苷容量，所以既容许DNA复制方式的修复也支持DNA同源重组方式的修复．类似的情况也见于使用单链DNA核酸外切酶扩大单链空缺区域，或者使用DNA聚合酶缩小单链空缺区域．随着DNA单链空缺区域的增大，DNA会比较容易出现自折叠，出现非B型DNA二级结构，如DNA发卡结构(DNAhairpins)、G-DNA四链结构(G-quadruplestructures)和H-DNA结构(H-DNAstructures)等等[6,7](表1)．这些不正常的DNA折叠将破坏程序化DNA的复制、损伤修复和重组过程．为了避免这样的事件发生，单链结合蛋白如大肠杆菌的SSB、真核生物的RPA以及其他单链DNA识别蛋白如大肠杆菌的RecF、RecR、RecO、RecA和酵母与哺乳动物的蛋白质复合体RAD51/Brca2，竞争结合到DNA单链空缺区域．显然，SSB/RPA结合到DNA单链空缺区域将利用复制型DNA聚合酶进行DNA复制，而Rec蛋白结合到DNA单链空缺区域将促进同源重组、SOS反应的诱导或者DNA跨缺刻合成[3,4,8～14]．752··邱洁芳等：大肠杆菌细胞DNA复制、修复和重组途径的衔接2008;35(7)酸酶结合去降解含错配碱基的新链，展开错配修复[17]．此外，茁clamp还能与DNA聚合酶玉、DNA聚合酶域、DNA聚合酶郁和DNA聚合酶吁相互作用，从而影响DNA复制、修复和跨损伤合成过程中不同DNA聚合酶之间的转换[18]．DNA聚合酶玉参与核苷酸切除修复和DNA复制时冈崎片段的合成．研究发现，大肠杆菌完全缺乏DNA聚合酶玉时在基本培养基里仍有生活力，这种生活力依赖于参与核苷酸切除修复的UvrA、UvrB和UvrD以及其他未鉴别的蛋白质，如聚合酶和核酸外切酶，它们接管了DNA聚合酶玉在DNA复制中的功能．这种替代复制途径有助于提高细菌逆境时的存活率[19]．DNA聚合酶吁和RecA是DNA损伤时跨缺刻合成的必要成分，DNA聚合酶吁和RecA相互作用会进一步加强DNA跨缺刻合成，构成一种新的DNA聚合酶调控机制[20]．1.2.2DNA修复与重组．参与核苷酸切除修复的UvrA、UvrB与同源重组RecF途径的RecQ螺旋酶能抑制某些类型的非法重组．在UvrA、UvrB突变体及UvrA、RecQ双突变体中，紫外线诱导的非法重组率增加[21]．UvrD也有抗重组功能[3,19]．UvrD能降低自发或紫外线诱导的非法重组率[22]．碱基错配修复对重组的抑制作用是由于错配修复对于杂交DNA序列(不包括完全相同的序列)中的非B型配对有很高的识别能力，在重组的各个阶段都会有被错配修复识别的底物，错配对识别蛋白与之作用并影响重组的进行．这种抑制对同源重组也存在影响．MutS、MutL提高了异源双链DNA形成的能障，使RecA-DNA或UvrAB-DNA复合体不稳定．抑制作用需要碱基错配结构的形成并利用ATP．对ATP缺陷型突变体MutS501，UvrAB对链交换的促进作用不被抑制[23]．因此，MutS-MutL复合体在大肠杆菌中可视为错配修复和抗同源重组的分子[24]．1.2.3DNA重组与复制．大肠杆菌为了生存，被异常Ter位点阻滞的复制叉采用同源重组的RecBCD途径和SOS诱导途径．此时，研究表明UvrD也是必要的．UvrD使Tus蛋白从Ter位点移开，以便重组依赖的复制叉通过Ter/Tus复合体[25]．复制位点前方的单链DNA区域，复制酶和重组酶在此时常发生竞争作用[26]．大肠杆菌中，RecA以及其他重组蛋白常在复制过程中出现，以便在损伤的复制叉处引发重组．RecA-ssDNA可作为SOS应答的信号分子，负责某些情况下DNA复制叉的回转，同时也参与DNA聚合酶吁催化的DNA跨缺刻合成[3]．螺旋酶Rep和PriA阻止RecAFig.1ModelofMutSfunctionwiththe茁clamp[17]图1MutS与茁clamp相互作用示意图[17]错配碱基聚合酶芋MutS聚合酶芋MutS扫描DNA茁Fig.2ModelofMutLfunctionwiththe茁clamp[17]图2MutL与茁clamp相互作用示意图[17]MutS位于错配碱基处的MutL的N端MutL的C端茁核酸酶螺旋酶茁DNA聚合酶753··生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2008;35(7)Fig.3SimilaritiesofintermediatesandconnectionbetweenDNAreplicationandhomologousrecombination图3DNA复制和重组途径具有相似的中间体单链DNA、单链DNA结合蛋白以及RecOR/Rad52家族蛋白的相互作用阻止ssDNA形成非B型二级结构．SSB/RPA3R过程螺旋酶DNA复制双链DNA单链DNADNA复制与重组的转换重组单链DNA-RecA/Rad51RecF/Rec0/RecR/Rad52/Rec55/Rec57BrcA2Rad51等Rec0/RecR/RecA通过LexA诱导SOS的这个行为，控制复制叉处重组的引发[27]．DNA结合蛋白RdgC也能调节RecA的活性[28]．此外，RecA蛋白能削弱体内DNA聚合酶域、吁的功能，可能对DNA聚合酶芋、郁也有同样的作用，影响DNA聚合酶调控的DNA复制、修复与重组过程[18].2总结与展望很多情况下，DNA的复制、损伤修复和重组与威胁人类健康的肿瘤和遗传病的发生密切相关．比如遗传性结肠癌与错配修复、皮肤癌症与核苷切除修复、人类染色体三体综合征与基因重组功能缺陷等，这些DNA修复缺陷细胞表现出对辐射和致癌剂的敏感性增加．此外，还有各种神经性疾病由DNA修复缺陷引起[29]，使得这一研究领域吸引了许多科学家的目光．现在关于DNA的复制、损伤修复和重组的研究有如下特点，一是对DNA的复制、损伤修复和重组所遵循的机制和有关的蛋白质分别进行更加深入彻底的研究，另一方面基于细胞是一个有机的整体，因此对各种途径之间的协调关系展开了广泛的研究．这样的研究现状体现了“部