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第一节病毒的纯化一、病毒纯化前的准备工作繁殖病毒利用生物学方法纯化病毒病毒感染的纯化与诊断二、标本的采取与送检•应注意下列原则：•1.对本身带有杂菌(如咽拭子、粪便)或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。•2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。•3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后各取血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。三、病毒和病毒成份的提纯•病毒纯度的判定依据：物理均一性；病毒滴度与蛋白含量的比例；免疫反应单一而无非特异反应；结晶形成•在病毒不失活的前提下，从宿主细胞中释放出来；•病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方法；•对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子，可以采用分级分离的技术。•病毒提纯的主要原则：四、病毒萃取液的分级纯化•沉淀法中性盐沉淀法聚乙二醇沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法•离心法差速离心法密度梯度离心法速率区带离心法等密度区带法凝胶色谱法电泳法•病毒的感染单位（IU）：能够引起宿主或宿主细胞发生一定特异性反应的病毒最小剂量；•病毒效价：指单位体积(ml)病毒悬液的感染单位数目(IU／ml)或称毒力；•噬菌体效价（pfu)：又称噬菌斑形成单位数指单位体积的噬菌体，能使感染细菌裂解，产生噬菌斑的数量。因为病毒粒子对细菌细胞感染率不会超过100％，所以根据噬菌斑或空斑计算出的病毒粒子数总比噬菌体电镜下观察数低。一、侵染力的测定第二节病毒的检测•半致死剂量(LD50)：使半数宿主细胞死亡的病毒剂量称半致死剂量；•半致感染剂量(ID50)：使半数宿主细胞发生感染的病毒剂量；•半数组织培养感染剂量(TCID50)：使半数组织培养物发生感染，产生细胞病变效应的病毒剂量。二、病毒的培养•1.动物接种•是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。•2.鸡胚培养•鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。•3.组织培养法(tissueculture)或细胞培养(cellculture)法•是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。1.细胞的变化①有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应(CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。②有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。③有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培养细胞中形成胞浆或核内的包涵体。病毒在培养细胞中增殖的指标•2.红细胞吸附(hemadsorption,HAd)•流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎动物(豚鼠、鸡、猴等)红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。•3.干扰现象(interference)•某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒(ECHOV)的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。•4.细胞代谢的改变•病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。(二)病毒的数量与感染性测定•1.蚀斑测定•是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料(如中性红)染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位(plaqueformingunit,PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。•2.50%组织细胞感染量(TCID50)测定法该方法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量。三、病毒感染的血清学诊断•原理是用已知病毒抗原来检测病人血清中有无相应抗体，故须待病人感染后体内产生抗体时才能检出。•另外，在采取临床标本及病人血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清(双份血清)进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，2.中和试验(neutralizingtest,NTtest)•是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。•中和抗体是作用于病毒表面抗原(衣壳或包膜)的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。1.免疫沉淀法使Ag-Ab形成不溶性的沉淀。3.补体结合试验(complementfixationtest,CFtest)•如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。补体结合试验图示受检系统指示系统溶血反应补体结合试验1、仅有抗原或抗体补体红细胞溶血素阳性阴性2、抗原抗体反应红细胞溶血素阴性阳性抗原抗体补体抗原/抗体5.酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA）以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。4.凝胶扩散法Ag和AbELISA的基本类型•先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。•根据检测目的和操作步骤不同，有竞争法、双抗体夹心法、间接法三种类型的常用方法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例,将抗原吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与待测抗原二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。竞争法此法常用于测定抗原,将已知抗体吸附于固相载体,加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。双抗体夹心法此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。间接法四、病毒核酸检测杂交法用于病毒检测的有斑点杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。PCR法目前多数病毒基因已通过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。反转录PCR基因芯片技术•又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。•其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果。其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。