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1基因治疗(GeneTherapy)的研究概况及前景展望摘要:基因治疗(GeneTherapy)是一种新的治疗手段，也是基因工程在应用领域一项较为常见的技术。主要是指向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段,以纠正或补偿基因的缺陷,关闭或抑制异常表达的基因,从而达到治疗遗传性或感染性疾病的目的[1]。它可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、传染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。实际上，基因治疗也遇到了很多困难。未来，基因治疗的主要目标是发展安全和高效的基因导入系统，它们能将外源遗传物质靶向性地导入到特异的细胞。本文主要介绍基因治疗的基本概念、基本方法及面临的主要问题，就基因转移的载体、基因表达的调控、基因治疗的安全性等方面的研究进展进行综述和评价，并探讨今后基因治疗的发展方向。关键词:基因治疗；基因导入系统；基因表达调控；安全性；发展方向21世纪是生物科学与生物技术的世纪，随着转基因技术、反义核酸技术、RNAi技术等基因操作方法的发展与完善，采用分子生物学手段治疗遗传疾病、2肿瘤、心血管和代谢性疾病等已成为本世纪的一大热点领域[2]。从1990年美国FDA批准第1项人类基因治疗的临床试验方案至今,基因治疗的研究已经走过了20年余的历程,其研究迅速发展,已取得很多突破，但仍处于比较幼稚的阶段，还不能成为临床常规的治疗手段[3]。目前，治疗已成为一项跨世纪工程，越来越多的受到科学界的关注，已有少数有确切疗效的临床试验。现将基因治疗及其研究的现状综述如下。1基因治疗的简介及概况1.1基因治疗的概念经典的基因治疗指在基因水平上对遗传缺陷进行纠正。但临床实践表明,基因治疗在后天获得性疾病如肿瘤等方面的应用,要远多于先天性疾病,所以现在基因治疗已转变为:为达到治疗目的而在基因水平进行的操作。基因治疗已从对单基因缺陷性遗传病的基因替代治疗,拓展至对致病基因的修正和基因增强治疗,以及采用外源调理性细胞因子基因、核酶类及反义核酸类基因药物进行治疗[4]。1.2基因治疗的种类[5]基因治疗根据靶细胞的类型可分为生殖细胞(germcell)基因治疗和体细胞(somaticcell)基因治疗。从理论上讲,体细胞基因治疗只涉及体细胞的遗传转变,不影响下一代,现已被广泛接受做为严重疾病的治疗方法之一,在现代伦理道德上是可行的。方法上易于施行,而且已取得了可喜的成果。根据基因转移的途径可将基因治疗分为invivo(活体直接转移,或称一步法)和exvivo(回体转移或称二步法)。前者指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸露的DNA直接导入体内。后者通过选择适当的靶细胞,在体外进行基因转移,筛选可表达外源基因的细胞,再将这些细胞转移至体内。体内法则是直接在体内改变与修复遗传物质,目前对其研究日益增多,可能将成为基因治疗最有前途的方法。1.3基因治疗的策略根据宿主病变的不同,基因治疗的策略也不同,概括起来主要有下列四种:(1)基因替代(genereplacement)，去除整个变异基因,用有功能的正常外源基因取代之,使致病基因得到永久地更正。(2)基因修正(genecorrection)，指将致病基因的突变碱基序列纠正,而正常部分予以保留。(3)基因增强(geneaugmentation)，指将目的基因导入病变细胞或其它细胞,目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。(4)基因抑制(geneconstraint)和基因失活(geneinactivation)，导入外源基因去干扰、抑制有害的基因表达。1.4基因治疗的基本环节1.4.1目的基因的选择用于基因治疗的目的基因选择原则为:(1)该基因的异常是疾病发生的根源;(2)该基因遗传的分子机制清楚;(3)基因已被克隆,一级结构和表达调控机制较为清楚;(4)可在体外操作,而且安全有效;(5)转移基因在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白质。随着分子生物学与基因重组技术的发展，基因获取的手段也逐步成熟。目前，获取目的基因的主要方法有利用分子生物学手段分离和克隆目标基因，如利用酶切或逆转录等方法，或采用人工手段合成目的基因片段。31.4.2靶细胞的分离与体外培养靶细胞（又称受体细胞）是接受外源基因的细胞，来源于被治疗的对象。合适的靶细胞是基因治疗成败的关键之一，选择时应考虑疾病的性质和部位，炫彩的容易程度，便于体外培养和遗传操作，以及要有可行的转移方法。根据疾病的性质、基因治疗的策略,靶细胞可以选择外周血淋巴细胞、骨髓造血干细胞、成肌细胞、成纤维细胞、角质细胞、呼吸道上皮细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞和神经胶质细胞等。1.4.3基因转移系统[6]基因治疗载体可分为病毒型和非病毒型两类。病毒型载体包括:逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和疤疹病毒,目前最有效的方法是使用经过改造的、具有穿膜特性的病毒作为载体,定向地将目的基因导入细胞。然而由于人体自身具有抗病毒的免疫系统,使用病毒载体作为媒介来传递DNA时就不得不面对宿主的免疫反应。非病毒型载体包括:脂质体、裸露DNA和DNA包装颗粒,范围从裸DNA显微注射,电激法、基因枪技术等各类物理学方法到聚阳离子赖氨酸或阳离子脂质体。1.4.4目的基因的表达与调控早期基因治疗的疾病主要选择如肺囊性纤维化、ADA-SCID等遗传缺陷性疾病,治疗基因导入体内后即使不进行精确的调控也可获得较好疗效。而在用基因治疗其它多种疾病时,对目的产物的需要量要求严格,若目的基因表达由载体或病毒启动子自发激活,表达不受控制,目的产物表达过度或不适当,不仅对疾病治疗不利,甚至可能引起致命的副作用,如糖尿病的胰岛素基因治疗、肾性贫血的EPO基因治疗等。目的基因表达的组织、时序及水平上的严格调控是这类基因治疗进入临床前必需解决的问题,即如何有效地调控外源基因在体内的表达,使其控制在适度水平。目前为止，外源基因导入并在靶细胞中表达已获得成功，但外源基因的表达量与生理水平却依旧有较大差距。因此，外源基因的表达与调控是目前基因治疗的难点与研究热点。目前人们正在通过定点插入以及连接强启动子等方法来提高导入基因的表达水平[7]。2基因治疗的应用现状2.1基因治疗在临床上的应用[5,8]2.1.1单基因疾病从1990年第1例SCID-ADA基因治疗方案至今,已有18种单基因遗传病开展了基因治疗临床试验。主要为肺囊性纤维化、戈歇病、血友病、a-抗胰酶缺失和严重联合免疫缺陷症(SCID-ADA、SCID-X)等。Marina等进行了SCID-X的Ⅱ期临床试验,通过体外逆转录病毒介导细胞因子γC受体基因转导患者造血干细胞,然后回输,结果从T、B、NK淋巴细胞的数量、功能以及抗原特异性反应方面均达到了与正常人相当的程度,且患者已能正常生活。单基因遗传病基因治疗的关键是外源基因能在体内长期稳定的表达。因此,选择合适的转移载体以及合适的靶细胞十分关键。腺病毒具有强的免疫原性,且其介导的外源基因不能整合,可能难以达到长期稳定表达的要求。虽然Marina等成功地运用了逆转录病毒载体,但由于其滴度及转导效率较低，只适于体外转导,因而需要进一步改进。研究人员认为,免疫原性低、可感染多种分裂相和非分裂相细胞、能够整合且适于体内转导的腺相关病毒和慢病毒,可能是治疗单基因遗传病的理想载体。2.1.2恶性肿瘤4几种肿瘤治疗的途径正在研究中。首先是增强肿瘤的免疫反应;第二是导入肿瘤细胞“自杀(suicide)”基因;第三抑制肿瘤细胞的生成,如导入抗癌基因和癌基因的反义基因。研究表明多种细胞因子如白细胞介素2(IL-2)、IL-4、肿瘤坏死因子(TNF)、γ-干扰素等基因转染肿瘤细胞,或肿瘤组织浸润的淋巴细胞(TIL)等,经扩增后输回人体,可以促进肿瘤抗原和MHC(主要组织相容性复合物)的表达,增强机体免疫反应的能力。另一进展是将MHC-Ⅰ型基因用脂质体包裹直接导入肿瘤内以提高免疫反应。免疫组化证实,经这样处理后缓解的肿瘤内有大量CD8+T细胞,提示该机制是CD8+T细胞介导的免疫排斥反应。“细胞自杀”涉及插入单纯疱疹病毒的胸腺核苷酸激酶(TK)基因。其原理为HSV-TK可将一种核酸类似物抗病毒药物gancyclovier(GCV)磷酸化成一种细胞毒药物,干扰靶细胞DNA合成,选择性杀死分裂细胞。Culver等将HSV-TK基因导入逆转录病毒载体,让其在包装细胞中复制包装。然后把转染后的包装细胞直接注入胶质瘤,一周后给GCV,使肿瘤基本消失。抑癌基因p53已被FDA批准治疗非小细胞肺癌患者,该病为p53基因缺陷。此外反义κ-rasDNA已被注射到肺癌患者体内,试图抑制已活化的癌基因活性。2.1.3AIDSAIDS是由HIV感染引起的。HIV是一个逆转录病毒,与靶细胞膜上的CD4分子结合后进入细胞,HIV基因组RNA在逆转录酶的作用下,逆转录成cDNA,然后整合至宿主染色体。HIV感染的基因治疗的策略主要有抗病毒基因治疗(细胞内免疫)和基因免疫治疗两方面。前者指将人工构建的一个重组基因导入易感细胞内,该重组的基因可在转染细胞中表达病毒基因的反义核酸或病毒蛋白的突变体,以便有效地干扰野生病毒的复制和增殖。如对HIV蛋白的基因修饰、反义RNA和核酶(ribozyme)等。后者包括体内直接注射DNA(基因免疫接种),以及转移针对HIV-1抗原特异性的携带自杀基因的CD8+T细胞,以治疗HIV感染。此外,阻断HIV和CD4结合也是治疗HIV感染的策略之一,即将重组的可溶性CD4基因直接注射或导入体外培养的人T细胞再输回体内。2.2基因治疗在其它领域中的应用几种释放激素、凝血因子、抗凝血剂和其它治疗因子的系统正用于基因治疗。当这些基因被导入成纤维细胞和血管内皮细胞后,他们的表达产物可在血液中检测到。最近对小鼠的研究结果表明,成肌细胞是释放重组蛋白的最佳靶细胞,它们可与邻近的肌纤维随机融合,并成为血管平滑肌组织中的一部分。如通过这种方式导入的人生长激素基因的小鼠,可在循环血液中检测出表达产物达6个月之久。通过体外基因转移制备工程细胞,将其植入脑内,也正用于慢性神经系统疾病的基因治疗,以恢复功能。如果这种基因转移/移植的联合技术被证明有效的话,则将提供一个治疗诸如帕金森氏病和早老性痴呆等症的新方法。3基因治疗中存在的问题及前景3.1存在的问题基因治疗应用到临床只有短短几年,虽然它对基础医学或临床医学的发展均起到了推动作用,但应清醒地看到,目前的基因治疗尚存在许多问题。3.1.1基因治疗本身存在的问题尽管现代科技的发展使得基因治疗日趋完善，但其仍存在目的基因少、缺乏高效的载体系统以及目的基因表达的可控性差等问题。因此，研究疾病的发病机5制，更好地了解致病基因及其作用机理；提高基因转移的效率、靶向性和安全性；深入研究基因的表达及其调控；建立良好的实验动物模型，为临床应用提供更可靠的数据等是目前基因治疗研究中应当着力解决的问题[9]。3.1.2伦理问题基因治疗价格昂贵，并不是每个公众所能享受的，这一点与医学是一种社会公益性福利事业的本质是相违背的。另外，就生殖细胞的基因治疗而言，基因治疗将改变性细胞中的DNA序列，并将这种改变传递给后代。同时，基因治疗还会加大老龄化程度，进而加重社会负担。除此之外，基因治疗还涉及患者知情权以及隐私问题等[9]。3.1.3安全性问题基因治疗的安全性是指基因治疗应确保不因外源基因的导入而引起新的有害遗传变异，因此，在进行基因治疗时选择一个安全有效的载体是相当关键的，载体不当引起的插入突变可能引发一个重要基因的失活，或者激活一个原癌基因，后果不堪设想。同时导入的外源基因一般不具有表达调控系统，其表达水平的高低可能会影响机体的一些生理活动。此外，转基因动物的成功使生殖细胞的基因治疗成为可能，但这种治疗所带来的遗传特征的变化是否会世代相传，这个问题科学界仍持有不同的态度。3.2前景展望基因治疗将是医学史上的一次革命,因为人自己、甚至人的疾病组织(如肿瘤)本身成为“基因工程的药厂”,生长出的药物(基