植物病原菌对杀菌剂的抗药性研究

植物病原菌对杀菌剂的抗药性研究摘要：植物病原菌杀菌剂是防治植物病害的重要手段，但近年来杀菌剂的抗药性问题呈现逐年增多的趋势，已引起相关领域的广泛关注。本文从抗药性病原菌的抗药性机制，抗性治理两个方面综述了植物病原菌杀菌剂的抗药性研究进展。关键词：杀菌剂；抗药性；研究进展植物病原菌对杀菌剂产生抗药性是植物病害化学防治中面临的主要问题之一,是指本来对农药敏感的野生型病原物,由于遗传变异而对药剂出现敏感性下降的现象。群体中抗药性菌株的频率和抗药性程度达到某一水平导致药剂常规使用剂量下的防治效果下降或失败,说明此时田间病原菌可能已出现抗药性[1]。联合国粮农组织(FAO)对杀菌剂抗药性推荐的定义是，遗传学为基础的灵敏度降低，特别是随着高效内吸选择性强的杀菌剂被开发和广泛应用，杀菌剂抗性越来越严重和普遍，成为制约化学防治措施发展的关键因素之一。二十世纪六十年代早期，大部分杀菌剂的抗性风险都很低，如铜、硫制剂等。1966年Noble等人发现麦类核腔菌对有机汞制剂，引起柠檬腐烂的指状青霉对环烃类杀菌剂联苯产生了抗性，但是抗性问题还没有达到很严重的程度。直到具有特异性作用方式的高活性化合物被开发出来以后，植物病原菌对杀菌剂的抗性问题才变得日益突出。据统计，植物病原真菌四大真菌亚门中多达近百种真菌对杀菌剂有抗药性发生。本文总结了近年来对植物病原菌杀菌剂的研究进展，为杀菌剂的开发和抗性治理提供参考。1病原菌抗药性机制1.1病原菌抗药性的遗传机制植物病原菌的抗药性可以由染色体基因或胞质遗传基因的突变产生。因此,可以将植物病原菌的抗药性分为核基因(nucleargene)控制的抗药性和胞质基因(cytoplasmicgene)控制的抗药性。植物病原真菌对大多数杀菌剂的抗性属于前一种情况;而存在于细胞质中的抗药基因,目前已知的主要位于真菌的线粒体和细菌的质粒中,真菌对少数药剂和细菌对大多数药剂的抗药基因属于这种情况。对于核基因控制的抗药性,又可以分为主效基因(major-gene)抗药性和微效多基因(poly-gene)抗药性[1]。1.1.1主效基因控制的抗药性主效基因抗性可分为单个主效基因控制的抗性,即单基因(single-gene)抗性,和多个主效基因控制的抗性,即多基因(mult-igene)抗性。对于单基因抗性,通常存在一种复等位基因抗性(multipleallelicresistance)的情况,即该基因座位上不同的碱基位点可以分别发生突变或同一碱基位点可以发生不同的突变,并能使病菌表现出不同的抗性水平,如灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)[2]、苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)[3]等对苯并咪唑类药剂的抗性。在多基因抗性中,其中的任何一个主效基因的突变都会使病菌产生抗性,如在脉孢霉(Neurosporacrassa)中有6个主效基因控制对二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性,其中任何一个基因发生突变都可表达抗性[4]。但当有2个或2个以上的主效基因同时发生突变时,存在2种情况,一是某一主效基因会对其它主效基因具有上位显性作用,即抗性水平与该主效基因单独突变时一致;另一种情况是主效基因间会发生互作,从而使得抗性水平不同于单一主效基因发生突变,如在尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)中,对苯菌灵的高水平抗性是由2个主效基因的互作引起的[5]。但无论在什么情况下,只要是主效基因控制的抗药性,田间病原群体或敏感性不同的菌株杂交后代对药剂的敏感性都呈明显的不连续性分布,表现为质量性状,很容易识别出抗药群体。1.1.2微效多基因控制的抗药性微效多基因抗性是指抗性由多个微效基因控制,且这些基因间具积加效应,即单个或少数基因的突变引起的抗性水平是微不足道的,病菌对药剂高水平抗性的产生需要多个基因的突变。由于不同抗药菌株中所携带的抗药基因数目的差异,使得田间病原群体或敏感性不同的菌株的杂交后代对药剂的敏感性呈连续性分布,表现数量性状,这也是区别于主效基因所控制的抗药性的基本特征。此类抗性病菌对药剂高水平抗性的敏感性下降，但很少表现完全失效，增加用药量或缩短用药周期可提高防效。使病原物表现数量遗传抗药性反应的杀菌剂有多果定、甾醇脱甲基抑制剂、放线菌酮、吗啉类和哌啶类及乙菌啶等。Polach根据田间群体对药剂的敏感性呈连续性分布以及遗传学的研究，认为Venturiainaequalis对多果定的抗性是由微效多基因控制的[6]在Nectriahaematococcavar.cucurbitae和Nectriahaematococcavar.pisi中,Demarkopoulou及DeFalandre分别研究其诱导的丁苯吗啉的抗药突变体都有3个与抗性有关的基因，而且具有积加效应，因此认为对该药剂的抗药性是微效多基因抗药性[7,8]。1.1.3胞质基因控制的抗药性目前已知大多数细菌的抗药基因主要存在于质粒DNA分子中,许多药剂如萎锈灵[9]尽管是干扰真菌的线粒体活性,抗性却是由核基因控制的,过去仅发现酵母对三烷基锡(trialkyltin)类药剂干扰病菌的氧化磷酸化)的抗药性是由线粒体DNA分子控制的[10],但近年来研究发现病原真菌对作用于菌体细胞色素bc1复合物的QoIs类药剂的抗药性也是由线粒体基因控制的[11]。1.2植物病原菌抗药性的生理生化机制1.2.1改变细胞膜细胞壁通透性病原物细胞可以通过某些代谢变化来改变细胞壁细胞膜的通透性，从而阻碍足够量的药剂通过细胞膜或细胞壁而到达作用靶点，使其无法发挥其杀菌作用来产生自我保护。如多氧霉素类是抑制菌体几丁质合成酶的生物活性，破坏细胞壁的生成的一类杀菌物质。而抗药性菌体的细胞壁结构发生变化，使抗菌素难以进入菌体到达作用部位而产生抗药性。有些病原菌避免其自身中毒的方式是在杀菌剂大量进入体内后，迅速地将杀菌剂排出体外，阻止药剂积累而表现抗药性。1.2.2改变杀菌剂毒性抗药菌株可通过某些变异影响生化代谢过程，在药剂到达作用位点之前就与细胞内其它生化成分结合而降低杀菌剂转毒能力，钝化乃至去除毒性，将有毒的农药转化成无毒化合物。祝明亮等研究认发现室内所得的稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)高抗突变体对硫代磷酸醋类杀菌剂的抗药性的抗药机制是，裂解有机磷类药剂“s-c”键以致使其失去生物活性[12].1.2.3降低药剂的亲和性病原菌可通过改变杀菌剂作用位点的结构，使杀菌剂与其作用位点的亲和能力降低，或改变其代谢途径，使杀菌剂无法在作用位点发挥作用，从而降低了杀菌剂的杀菌能力。研究发现病原菌β-微管蛋白发生变化，导致苯并咪唑类杀菌剂与病原菌亲和性下降是病原菌产生抗药性的主要原因。Butters在研究病菌对苯并咪唑类药剂的抗性分子机制的研究发现，田间抗药性菌株大都主要涉及198和200位置氨基酸的改变[13]。这些作用靶标构象的改变降低了药剂与靶标的亲和性，从而使得病原菌表现出抗药性。2杀菌剂抗药性的治理植物病原菌抗药性的产生给农业生产和农药行业造成了难以估计的经济损失。药剂防治的失效使用药次数和用药剂量增加，最后不得不换用更昂贵的新型杀菌剂。而新药剂的发现、发展、登记注册和生产，因交互抗性和多种抗性而变得越来越难。因此，发展新农药的速度大大落后于抗药速度，若不采取措施，则我们用于对付有害生物的有效杀菌剂将越来越少。如何克服或延缓病原菌抗药的产生和发展，以延长杀菌剂的有效使用寿命，已经成为植物病原菌抗药问题中所面临的最主要难题。2.1加强药剂的抗性风险监测风险评估，建立各病原菌和杀菌剂的抗性风险级别。随着分子生物学技术的突飞猛进，采用分子生物学方法进行抗药性检测可以快速，准确地检测到抗性频率很低(小于1/10000)突变群体从而弥补了传统检测方法的不足[14]。但分子检测方法的应用前提是需要了解病原菌对杀菌剂抗药性突变位点，所以要与传统检测方法相配合使用以达到最佳效果[15]。通过建立各病原菌和杀菌剂的抗性风险级别来决定合理的用药方法。风险系数高的，连续使用次数应当减少并与风险系数低的杀菌剂轮换使用，从而有效地预防和延缓抗药性的出现。2.2在确保传统的保护性杀菌剂有一定量的生产和应用的同时，根据植物与病菌之间的生理生化差异开发和生产不同类型的安全、高效专化性杀菌剂，储备较多的有效品种。如几丁质是真菌细胞壁的主要结构成分，而不存在于植物组织中。真菌与植物体内组装纺锤体的微管蛋白结构、蛋白质合成机制及RNA合成酶系等也不同。此外，真菌与植物体生物膜结构组分的差异，也已成为人们开发研究新杀菌剂的热点。随着杀菌剂毒理学等方面研究的深入，还可能发现病原菌与其它生物之间更多的生化差异用来开发新农药。2.3开发具有负交互抗药性的杀菌剂是治理抗药性的有效途径。如对苯并咪唑类杀菌剂有负交互抗药性的苯-N-氨基甲酸酯类的乙霉威已在我国生产应用。通过研究具有交互抗性的杀菌剂构效关系，为创制作用机制新颖的杀菌剂提供指导。2.4在了解杀菌剂的生物活性、作用机理和抗药性发生状况及其机理的基础上，创制不同作用机制的新杀菌剂或利用现有药剂混配，选用科学的混剂配方。例如三唑醇和十三吗啉都是抑制麦角甾醇生物合成，防治白粉病的特效药剂，但前者作用位点是碳十四位的去甲基反应，后者是阻止△8→△7异构反应，两者混用既可防止抗药性发生，又可增加防效。3展望植物病原真菌杀菌剂抗药性研究要充分利用生物化学、遗传学、群体生物学等各学科的综合知识，进一步加强交叉学科的分析研究，来全面研究抗药性发生与流行、抗药性机制、抗性利用等等，最终为抗药性治理提供充分的依据。加强培育抗病品种预测预报等综合防治措施，对延缓抗药性的形成也是十分重要的。此外随着生物技术的发展对植物病原菌抗药性基因的利用已取得了初步的进展。我们要持续推动化学防治与生物防治的结合加速综合防治的发展。参考文献[1]周明国.植物病原物抗药性[A].周明国主编.中国植物病害化学防治研究[C].北京:中国农业科技出版社,1998.50-61.[2]FaretraF,PollastroS.GeneticbasisofresistancetobenzimidazoleanddicarboximidefungicidesinBotryotiniafuckeliana(Botrytiscinerea)[J].Mycol.Res.,1991,95:943-951.[3]ShabiE,KatanT,MartonK.InheritanceofresistancetobenomylinisolatesofVenturiainaequalisfromIsrael[J].PlantPathology,1983,32:207-211.[4]GrindleM,TempleW.FungicideresistanceofosmutantsofNeurosporacrassa[J].NeurosporaNewsletter,1982,29:16-17.[5]MolnarA,HornokL,MiklosP.ThehighlevelofbenomyltoleranceinFusariumoxysporumisdeterminedbythesynergisticinteractionoftwogenes[J].ExperimentalMycology,1985,9:326-333.[6]PolachFJ.GeneticcontrolofdodinetoleranceinVenturiainaequalis[J].Phytopathology,1973,63:1189-1190.[7]DemarkopoulouMG,ZiogasBN,GeorgopoulosSG.Evidenceforpoly-genecontroloffenpropimorphresistanceinlaboratorymutantsofNectriahaematococcavar.cucurbitae[J].ISPPChemicalControlNewsletter,1989(12):34-35.[8]DeFalandreA,Dabou