NGS建库捕获试剂盒操作手册

上海迪赢生物科技有限公司NGS建库捕获试剂盒操作手册版本：P001-002019年10月本产品仅供科研使用，不用于临床诊断目的。上海迪赢生物科技有限公司试剂组分组分名称96rxn保存温度01文库构建试剂盒末端修复加尾缓冲液652.8ul-20℃02末端修复加尾酶115.2ul-20℃03连接缓冲液1536ul-20℃04连接酶960ul-20℃05接头混合液240ul-20℃06PCR混合液4800ul-20℃07QU试剂288ul-20℃08前PCR引物混合液480ul-20℃09杂交捕获试剂盒-1杂交液1662.4ul15-25℃10杂交液2331.2ul15-25℃11洗液176.8ml15-25℃12洗液219.2ml15-25℃13洗液357.6ml15-25℃14杂交捕获试剂盒-2杂交液3254.4ul-20℃15探针保护液48ul-20℃17封闭液739.2ul-20℃18后PCR引物混合液96ul-20℃19Index引物试剂盒Index引物（1-96）5ul/条-20℃上海迪赢生物科技有限公司1.实验准备1.1客户自行准备试剂：（1）无核酸酶水（2）80%的乙醇溶液（需现配现用）（3）纯化磁珠（4）PH8.0的LowTE溶液（10mM的Tris-HCL(PH8.0)，0.01mM的EDTA）1.2使用Nanodrop对抽提好的基因组DNA进行纯度检测。1.3使用Qubit对抽提好的基因组DNA进行定量。1.4使用0.8%的琼脂糖电泳或安捷伦4200对基因组DNA进行降解程度评估。1.5对于FFPE样本，建议采用QPCR方法定量可扩增DNA，如果采用Qubit定量，请根据样本的降解程度相应提高样本起始量，如果样本量充足，尽可能使用不低于200ng的DNA。1.6在一个新的PCR或1.5mLEP管中加入总量为10-200ng的DNA样本，用无核酸酶的水补足至50uL，放置于冰上备用。2.文库构建2.1启动CovarisS220system：确保新鲜的去离子水超过Covaris槽上level12；事先预冷并脱气半小时。2.2转移50μl的DNA样本到CovarismicroTube，贴壁慢慢打出液体，小心不要在tube底部产生气泡。2.3在CovarisS220和M220的超声条件设置如下：仪器型号S220M220BathTemperature(°C)720PeakIncidentPower(W)10075DutyFactor(%)3020上海迪赢生物科技有限公司CyclesPerBurst1000200TreatmentTime(s)1302052.4取42ul超声产物转移至PCR管中，在冰上加入6.8uL的末端修复加尾缓冲液（蓝盖1号管）和1.2uL的末端修复加尾酶（蓝盖2号管），吹打混合均匀。2.5放置于PCR仪上执行以下程序：2.6取出连接混合液（橙盖3号管）、接头混合液（棕盖5号管）和连接酶（橙盖4号管），按照下表所示，配置接头连接的反应体系：2.7吹打混合均匀，瞬时离心。2.8放置于PCR仪上执行以下程序，同时取出磁珠室温孵育30min备用，用无核酸酶水配置足够80%的乙醇。STEPTemperature（℃）Time12515min24HoldSTEPTemperature（℃）Time13030min26530min34Hold组分体积（μl）上步产物50接头混合液2.5连接混合液16连接酶10Nuclease-FreeWater1.5总共80上海迪赢生物科技有限公司2.9加入64ul的纯化磁珠，Vortex混合均匀。2.10室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上。2.11放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。2.12加入200uL的80%乙醇，静置30秒后弃上清。2.13加入200uL的80%乙醇，静置30秒后弃上清。2.14快速离心后用10uL的移液器弃去残余乙醇，室温放置1-3分钟，确保乙醇挥发干净，但不要干燥过度防止文库产量降低。2.15从磁力架上取下管子，加入14uL的无核酸酶水重悬磁珠，Vortex混合均匀，室温放置2分钟。再加入25uL的PCR混合液（灰盖6号管），3uL的EU试剂（棕盖7号管），8uL的前PCR引物混合液（白盖8号管），Vortex混合均匀。2.16按照如下PCR条件执行PCR扩增：STEPTemperature（℃）Time13715minutes29845seconds39815seconds46530seconds57230seconds6RepeatStep3throughStep5foratotalof7-11times.7725minutes84HoldPS：建议起始循环数采用8个循环，如果产量超过1.5ug，可降为7个循环，如果产量低500ng，则增加1-3个循环。上海迪赢生物科技有限公司2.17在PCR管中加入30uL水和64uL的AMPure磁珠，纯化步骤同2.10-2.14，最后用30uL的无核酸酶水洗脱。*质控步骤：安捷伦2100或4200仪器检测片段范围和QubitBR测定浓度。片段范围在225bp~275bp。产量不低于500ng。3.杂交捕获3.1取500ng-1.5ug建库文库使用浓缩干燥仪进行浓缩，温度不超过45℃，刚好干燥完成后加入5ul无核酸酶水和7.7ul的封闭液（黄盖17号管）充分震荡混匀，放置于PCR仪上95℃5min，65℃5min，65℃Hold。PCR带热盖模式运行。3.2在1.5mLEP管中制备如下杂交混合液，根据样本量配置单个或多个：依次加入6.9uL杂交液1（紫色盖09号管）3.45uL杂交液2（绿盖10号管）和2.65uL杂交液3（蓝盖14号管），使用旋涡混匀仪剧烈震荡5秒后快速离心，放置于65度金属浴或水浴孵育5min。再加入0.5uL的探针保护液（橙盖15号管）和捕获探针（红盖）。根据实际捕获区域大小，全外显子和大于3Mb的定制Panel使用5ul探针；0.5Mb-3Mb的定制Panel使用2ul探针，并补充3ul的无核酸酶水；3.3使用旋涡混匀仪剧烈震荡2秒后快速离心。3.4转移全部18.5uL的杂交探针混合溶液到3.2步的文库混合液中（一直保持在PCR仪上操上海迪赢生物科技有限公司作），轻轻吹打10次。3.5密封好管盖，在65℃杂交16小时。3.6实验前至少2小时将洗液3（橙盖13号管）放置65℃水浴锅预热（每个样本需要600ul，温度计测量水温确保水浴锅的65℃非常准确）。3.7在漩涡震荡器上重悬QuarAccesHyperEnrichmentbeads（室温平衡30分钟以上）。3.8每个反应吸取50μlQuarAccesHyperEnrichmentbeads到1.5mlLoBind管中。3.9加200μl的洗液1（棕盖11号管）；在漩涡振荡器上震荡5秒钟，充分混匀磁珠，快速离心；把管子放在磁力架上；去除上清液；重复步骤，总共3次清洗；最后用200μl的洗液1重悬磁珠，室温放置待用。3.10杂交混合液65℃孵育约16小时后，确保剩余杂交体系体积不低于20uL。然后直接在PCR仪上打开PCR管，将杂交混合液吸出，加入200uL磁珠混悬液中，震荡混匀5秒。3.11室温将管子放置在垂直旋转器上旋转孵育30分钟。3.12从旋转器上取下8连管或96孔板，简短离心后，放置磁力架5分钟，待液体清澈后，吸走上清。3.13加200μl的洗液2（黄盖12号管）来重悬磁珠，在振荡器上混匀5秒钟，室温孵育15分钟，每间隔5分钟，在漩涡振荡器上振荡一次。3.14简短离心后，放置磁力架上待液体清澈后，吸走上清液；放置65℃的PCR仪上，马上加100μl的在3.6步预热好的洗液3，在PCR仪上吹吸10次使磁珠完全混匀，65℃孵育10分钟。3.15重复步骤3.14，共3次，注意第二次和第三次洗的过程在磁力架上的时间尽可能短，最后吸走上清后再简短离心，用20uL的移液器吸走残余液体。3.16加19µL无核酸酶水重悬磁珠，上下吹打均匀后全部磁珠悬液加入新的PCR管。上海迪赢生物科技有限公司3.17在19uL的磁珠混悬液中加入25uL的PCR混合液(透明盖6号管)，1uL的后PCR引物混合液（透明盖18号管）和5ul的index引物（白盖）。上下吹打混合均匀，注意不要快速离心。3.18放置于PCR仪上，按照如下PCR条件执行PCR扩增：STEPTemperature（℃）Time19845seconds29815seconds35730seconds47230seconds5RepeatStep2throughStep4foratotalof10-14times.6725minutes74HoldPS：全外显子和大于5Mb的定制Panel采用10-11个循环；3Mb-5Mb的定制Panel采用11-12个循环；0.5Mb-3Mb的定制Panel采用12-13个循环；小于0.5Mb的定制Panel采用13-14个循环；3.19将PCR管放置于磁力架上，静置1分钟后吸取大约50µL的上清液转移至新的PCR管中（注意：上清液中包括捕获后文库，请勿遗弃），然后加入40µL混匀AMPureXP磁珠，吹打混匀。3.20室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上。3.21放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。3.22加入200uL的80%乙醇（当天配置），静置1分钟后弃上清。3.23再次加入200uL的80%乙醇（当天配置），静置30秒后弃上清，快速离心后弃去残余乙醇，室温放置3分钟。3.24从磁力架上取下管子，加入30uL的LowTE缓冲液洗脱，吹打均匀。上海迪赢生物科技有限公司3.25放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中。4.文库质检和上机准备4.1使用AgilentBioanalyzer4200或2100仪器对样本进行质检，4200所需试剂为HighSensitivityD1000或D5000ScreenTape，2100所需试剂为HighSensitivityDNAAssay。4.2杂交捕获文库的峰形如下图所示，峰值约为250~350bp,一般的浓度约5~50nmol/μl。4.3推荐使用Illumina平台2*150测序模式，Index为单端i7（8bp）Index。对于新鲜FFPE样本测序数据量基于Panel大小和期望测序深度；对于中度降解样本（DIN值在3~8）测序数据量额外提高2~4倍；对于严重降解样本(DIN值小于3）测序数据量需额外提高5~10倍。杂交捕获文库峰形图（AgilentTapeStation4200）杂交捕获文库峰形图（AgilentBioanalyzer2100）上海迪赢生物科技有限公司Index附表序号板号index序号板号index序号板号index1A01GACGGATT33A05CTTGTACT65A09TAGTGACT2B01GAATCTGT34B05CAGATCTG66B09GCAATCCG3C01GAGGTGCT35C05TAGACGGA67C09TGGTTGTT4D01GTTGTCGG36D05TTGCGTAC68D09TTCGCACC5E01GCACTGTC37E05TCGTTAGC69E09TACCGAGC6F01GATTCATC38F05TATGTGGC70F09TGTCTATC7G01TCTCGGTT39G05TTCAGCTC71G09TACTAGTC8H01GATAGAGG40H05TCAGATTC72H09TCTCACGG9A02TACTTCGG41A06GCTCCTTG73A10TACAGGAT10B02GTCGCTAT42B06GCAACATT74B10TGCGATCT11C02GGTCGTGT43C06TCATTGAG75C10TGACCACT12D02GTGTCCTT44D06TAACGCTG76D10GACCTTAG13E02GAGCCAAT45E06TAAGCGTT77E10ACTTGATG14F02GCCTGTTC46F06GGTGAGTT78