第二代测序技术

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第二代高通量测序技术简介四大高通量测序平台Solexa,454(GS-FLX),SOLiD和Polonator测序原理合成法测序(SequencingbySynthesis)连接法测序(SequencingbyLigation)454(GS-FLX)Roche:(2005,2007,2008)原理:在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下,将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来,通过检测化学发光信号的有无和强度,达到实时检测DNA序列的目的。454(GS-FLX)流程1、文库制备:基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间,经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA。454(GS-FLX)流程2、EmulsionPCR:单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上,乳化,形成油包水的混合物,每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增,回收纯化;454(GS-FLX)流程3、测序反应:携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。454(GS-FLX)流程4、数据分析:GSFLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长,读取超过4-6亿个碱基信息Solexa-IlluminaGenomeAnalyzer核心技术:“DNA簇”和“可逆性末端终止”。原理:将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即Flowcell),这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在Flowcell上形成了数以亿计Cluster,每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。SOLiDABI(AppliedBiosystems):SOLiD(SequencingbyOligonucleotideLigationandDetection)原理:用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列,随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列,把SOLiD颜色序列定位到reference上,同时校正测序错误,并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。SOLiD流程1、SOLiD基因组文库的构建SOLiD流程2、油包水PCRSOLiD流程3、含DNA模板P1磁珠的固定SOLiD流程4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程SOLiD流程4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程SOLiD流程5.数据分析原理Polonator测序原理:Polonator系统高质量测序是一种以连接反应进行DNA序列分析的技术,该系统采用结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板,以CY5、TexasRed、CY3、6-FAM四色荧光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续的连接反应为基础,对扩增的DNA片段进行大规模高通量测序。Polonator流程

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