CpG-ODN的免疫刺激作用

CpG-ODN的免疫刺激作用陈军浩南京大学医学院附属鼓楼医院CPG概念为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列，即CpG基序。一种免疫佐剂作用靶点TLR9细胞免疫，体液免疫Th1免疫应答慢性乙型肝炎患者细胞免疫低下HBV免疫耐受，持续感染肿瘤微小残留病的清除CPG提高PBMC中Th1细胞Th1占淋巴细胞百分比CPG提高PBMC中Th1、Tc1细胞百分率0246810121416Th1Tc1Th2对照CPG-ODN***：与对照组比较，P0.05CPG刺激BPMC分泌细胞因子01020304050607080IFN-γIL-2IL-4IL-10对照组CPG-ODN组**：与对照组比较，P0.05CPG诱导PBMC杀伤靶细胞1.收集CPG活化的PBMC2.细胞毒性实验：效应细胞为CPG活化的PBMC；靶细胞为CFSE预染的K562细胞。对照组效应细胞为未经CPG活化的PBMC。3.效：靶＝20：1，混合培养2h。流式细胞术检测靶细胞死亡率。CPG诱导PBMC杀伤靶细胞CFSE染色靶细胞1.浓度为5μmol/L的CFSE（2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）工作液2.取对数生长期的靶细胞浓度108/L3.细胞悬液与等体积CFSE工作液混合4.37℃孵育10min。5.离心洗涤两次后6.悬浮细胞备用CFSE染色靶细胞实验结果CpG活化PBMC对K562细胞的杀伤作用(N=5)CPG活化PBMC16.85±5.14%对照组8.62±2.83%**：与对照组比较，P0.05CIK细胞杀伤靶细胞CIK细胞杀伤靶细胞研究背景通过主动免疫、过继特异性免疫、过继非特异性免疫等方式，清除慢性乙肝患者体内残存的HBV，达到治疗效果。研究背景B淋巴细胞具有抗原递呈细胞的性质，同时具有CpG-ODN受体：TLR-9。本研究探讨CpG-ODN诱导B淋巴细胞成为高效APC，使之具有类似于树突状细胞功能的可行性。TOLL受体TOLL受体在血细胞中的表达活化B细胞负载核心抗原1.磁珠分选B淋巴细胞2.CPG活化B淋巴细胞3.核心抗原肽:FLPSDFFPSV-FITC4.流式细胞仪、荧光显微镜检测抗原负载状况磁珠分选B细胞分选前B细胞7.89%分选后B细胞89.6%活化B细胞负载抗原肽Marker%GatedAll100.00M141.34M1活化B细胞负载核心抗原荧光显微镜观察B细胞负载HBcAg18-27肽APC与T细胞作用机制CPG对B细胞抗原递呈相关分子的作用研究1.CpG2006、2216由上海生物工程技术服务有限公司合成，全硫代化修饰2.对照组为含10%FCS的RPMI1640＋外周血PBMC，细胞量107/孔，37℃、5%CO2、48小时3.实验组加入CpG2006或CpG2216，终浓度均为1umol/mL，余同上CpG提高淋巴细胞CD69表达05101520253035对照CpG2006CpG2216对照CpG2006CpG2216T淋巴细胞B淋巴细胞CD69表达率（%）***：与对照组比较，P0.05B细胞CD80、CD86表达对照组加CPG-ODN组加CPG-ODN组CpG提高B细胞表面CD80、CD86的表达01020304050607080对照Cp2006CpG2216对照CpG2006CpG2216CD80CD86CD80、CD86表达率（%）*****：与对照组比较，P0.05B细胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达对照组加CPG-ODN组CpG提高B细胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达05001000150020002500对照CpG2006CpG2216对照CpG2006CpG2216MHC-ⅠMHC-ⅡMHC表达量（MFI）*****：与对照组比较，P0.05活化B细胞诱导CTL1.负载了抗原的活化B细胞与淋巴细胞混合培养(含IL-2的RPMI1640培养液).2.收集细胞,以五聚体技术检测HBV特异性CTL.3.实验组特异性CTL为0.50±0.19%，对照组为0.20±0.10%。特异性CTL诱导Pro5TMMHCPentamers检测对照组和实验组HBcAg18-27抗原特异性CTL（Q2-1区）。前者为对照组（未加APC），后者为实验组（加APC）。结论1.CpG能够活化B细胞，对T细胞无明显的作用2.CpG能够提高B细胞表面抗原递呈相关分子的表达3.CPG诱导PBMC产生高水平的IFN-γ4.CPG诱导淋巴细胞向Th1、Tc1分化5.CPG增强PBMC对K562细胞的杀伤作用6.通过B细胞介导,CPG可诱导特异性CTL