《中国药典》薄层色谱的基本要求

《中国药典》薄层色谱的基本要求周兰贵州省食品药品检验所中药（民族药）室2014年5月内容薄层色谱技术在中药标准的优势《中国药典》薄层色谱的基本要求薄层色谱应用的影响因素薄层色谱技术在中药标准的优势薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB），系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，将所得色谱图与对照物按同法所得的色谱图比较，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定的方法。薄层色谱技术在中药标准的优势薄层色谱独有的特点是分析结果以直观的彩色图像表达，为其它色谱技术所不能。而图像给出的多层面的信息是文字难以表达的，而且丰富多彩的图像可以给分析者更多的思考判断的空间。提供直观的彩色图像是薄层色谱独有的特点离线操作的灵活性各单元操作既有关联，又相互独立，点样器材和方法、展开方式、显色试剂选择、直观比较或扫描比较可根据需要灵活变通。根据需要操作可以视实际需要和实验室条件分层次进行和终止，节省分析时间和资源。由于是离线操作，所以个人占机时间短。正相色谱流动相（展开剂）的广泛适用性薄层色谱最常用的是以硅胶板为基础固定相的正相色谱，有多种组合的有机溶剂展开系统可供选择；甲苯系统；三氯甲烷系统；己烷系统；正丁醇系统；乙酸乙酯系统等等。酸性、碱性、中性。高极性、中等极性、低极性。色谱后衍生的专属性色谱后灵活方便的衍生技术，同一色谱薄层板可生成可见光谱、紫外光谱、荧光淬灭光谱或荧光光谱，给出丰富的检测成分的化学类别信息。如三氯化铝试剂是黄酮类化合物的专属试剂；碘化铋钾是生物碱类成分的专属试剂；三氯化铁是酚类成分的专属试剂；醋酐硫酸是三萜类和甾醇类成分的专属试剂等。硫酸则是许多成分激发产生荧光的通用试剂，非常方便。同板多个样品平行比较成本相对低廉、色谱生成快速、同板可以同时产生多达16~18个样品色谱，共平行直观地比较，色彩丰富的图像给人的视觉冲击远远大于较为“呆板”的轮廓色谱图，可以迅速地、粗略地，而且颇为有效地评价样品色谱图像之间的相试程度。《中国药典》薄层色谱的基本要求供起草标准用样品的要求中成药薄层色谱鉴别中药材薄层色谱鉴别中药标准制定技术要求原则保证用药安全科学、先进、规范、适用促进标准国际化中药标准制定技术要求中药标准制定《国家药品标准工作手册》中药质量标准研究制定技术要求方法学验证中药质量标准方法学验证指导原则（中国药典2010版一部）供起草用样品的要求研究用样品应具有代表性，覆盖面要广，一般至少收集15批以上样品供研究用；对于多来源品种，每种收集3~5种；相关信息包括：产地（如有可能表明野生或家种）、收集地、收集时间、收集人独家生产的应不少于10批，多家企业生产的应尽量收集每家企业的样品，5家以上企业生产的应至少收集5~10家企业生产的样品样品量除满足起草研究、留样观察外，还应有不少于3倍检验量的样品供复核用供起草用样品的要求注意中药材、饮片要求专家鉴定对于具有多种不同规格的中成药，应收齐全部规格的样品试验用样品必须采用合格原辅料依法生产的样品，收集的每批样品均要有该企业的原辅料和成品的自检报告及详细生产工艺供起草用样品的要求阴性对照样品生产单位应尽可能提供研究单位自制阴性样品系指按处方除去被测定的药味，按制法制备的样品，注意应包括所有的辅料和工艺步骤，制成量应与原标准相符鉴别鉴别显微鉴别理化鉴别色谱鉴别特征图谱鉴别一般理化鉴别荧光鉴别光谱鉴别薄层色谱鉴别液相色谱鉴别气相色谱鉴别中药材薄层色谱鉴别尽量采用对照品和对照提取物或对照药材同时进行对照图谱清晰、斑点明显、分离度与重现性符合要求根据被测物的特性选择合适的固定相、展开剂及显色方法等色谱条件色谱条件的优化应对三个以上的展开系统进行考察确定供试品取样量、提取和纯化方法、点样量等条件选择合适的对照物质，确定对照物质用量、浓度、溶剂、点样量等中药材薄层色谱鉴别验证专属性重复性耐用性重现性多来源药材、饮片的色谱行为是否一致混淆品的区别斑点是否重叠不同品牌的薄层板或自制薄层板考察考察至少2~3个品牌或厂家的薄层板，不同温度、湿度考察，在5℃~35℃考察高低2个温度；在低相对湿度（RH）15~30%和高相对湿度75~90%各考察一个相对湿度中成药薄层色谱鉴别（1）薄层色谱具有分离与鉴别的特性，并具有直观、承载信息大、专属性强、快速、经济、操作简便等优点，是中成药鉴别的首选方法。（2）新建立的薄层色谱应该图谱清晰，斑点明显，分离度、专属性、重现性与耐用性符合要求，并需要提供图谱；（3）应尽量与该药材和饮片的薄层色谱鉴别方法一致，如因其他成分干扰或制剂的提取方法不同，可增加提取纯化处理或展开剂优化。新增薄层色谱鉴别要求供试品溶液的制备：应尽可能除去干扰，同时方法尽量简便，首先进行提取、纯化选择，如回流、超声提取方法，溶剂、时间，酸碱处理，溶剂萃取，柱子纯化等的选择对照品选择：尽量采用以对照品和对照提取物或对照药材同时进行对照。当对照品不易获得时，可采用对照提取物或对照药材为对照薄层板的选择：吸附剂的比较，选硅胶G板还是GF254板新增薄层色谱鉴别要求点样量选择：不同点样量的比较展开剂选择：对三个以上的展开系统进行考察比较显色条件选择：日光、紫外光、显色剂阴性空白试验：以证明其他药味无干扰耐用性：不同厂牌的薄层板、温度、相对湿度等注意（1）使用对照药材应保证药材的主斑点在样品中均有对应斑点（可参照制法对药材进行前处理），供试品色谱中不能只有对照药材色谱中的1~2个次要斑点相对应（2）尽可能采取一个供试液多项多维鉴别使用的薄层色谱方法，达到节约资源、保护环境、简便实用的目的（3）注意”过柱“的影响，不同品牌、不同批号的吸附剂吸附能力有的不同（4）对原方法的验证注意原标准点样量按手铺板制定，现用市售薄层板点样量过大分离度差，点样量可减少薄层色谱应用的影响因素样品预处理薄层色谱的点样技术吸附剂活性溶剂蒸汽在薄层色谱中的应用温湿度对薄层色谱的影响薄层色谱的优化及溶剂系统（展开剂）的选择薄层板样品预处理要得到一个较为清晰的色谱，样品提取物经预处理，使供试品溶液得以净化，往往是一个重要的有时甚至是关键的步骤提取溶剂的要求：溶解度不宜太大，黏度不宜太高，沸点适中供试品溶液净化的方法（1）单一溶剂提取法根据被测物质的化学特性，有选择性地采用某种溶剂直接提取制备。（如浙贝母、平贝母、华山参、洋金花等）（2）分段提取法；被检测样品不同极性部位分别提取后制成相应供试液，分别检测分析（如丹参）（3）特殊提取方式如蜜丸等含糖较高又有黏性的样品，有机溶剂较难渗透到样品的内部，可加硅藻土、滑石粉等分散剂共同研匀后再提取。供试品溶液净化的方法（4）液-液萃取法利用样品与杂质在两相（水相和有机相）中溶解度的不同，达到净化目的。特别适合合剂、口服液、糖浆剂、注射剂等的处理。（5）固-液萃取法固相小柱萃取基本上是基于吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离子交换原理富集待测成分，去除部分杂质。点样点状或条带状点样？点状点样：简单快速缺点：接触式点样，易损伤薄层板表面点样量小斑点容易点大，易产生容积环形色谱效应，影响分离效果条带状点样优点：一般喷雾式，不损伤薄层板表面点样量比点状点样大原点不会上下扩散，分离度增加点样点多少？常规的TLC：0.5-5μl，高效TLC：HPTLC：＜1μl；用什么点？常规：手工一般使用定量毛细管（0.5/1/2和5μl），点样是毛细管必须完全充满和完全排空，要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，（玻璃毛细管不易损伤预制板的板面），切忌斑点或条带在原点因溶剂过大造成原点的扩散，一般建议控制在5μl以下。装置：手工点样器半自动点样器全自动点样器展开-展开溶剂使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”有毒试剂如“苯”禁用，“三氯甲烷”慎用（三氯甲烷目前仍有使用，否则许多鉴别无法进行，有的例子是难以取代的）；溶剂组成采用体积比（如乙酸乙酯-甲醇-甲酸=8:2:0.1，或写作80:20:1V/V/V)。甲酸一般虽然用量很微，但应准确加入。溶剂总量应足以使薄层板的浸入深度约为5mm（展开剂量的多少会影响斑点的Rf值）展开剂要求新鲜配制，一般不用多次反复使用，如展开溶剂混合放置后有分层现象，则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用。展开-饱和与预平衡溶剂的蒸气相在展开缸中也参与色谱展开而形成三维的层析过程，即固相-板上的吸附剂、液相-展开剂、气相-溶剂蒸气三相相互作用；如处理不好，会产生如下现象：展开过程中展开剂的组分被固定相分离产生第二前沿。未平衡或平衡时间不够易产生边缘效应。该怎样饱和呢？展开缸预平衡或饱和：展开前将展开剂置展开缸中，其蒸气在展开缸中平衡一段时间（15-20min）后迅速放入薄层板展开；预吸附：将薄层板放在展开缸中，不与展开剂接触，吸附一定量的溶剂蒸气可以改变层析行为，得到不同的色谱；饱和方式方法A（展开缸、薄层板均不饱和）方法B（展开缸饱和、薄层板不饱和）方法C（展开缸、薄层板均饱和）展开-展开剂优化展开剂在色谱展开中起着关键作用，至今植物药分析的薄层展开剂的优化基本上还是依靠经验。主要是因为植物药含有太多的未知成分，色谱行为各不相同，所以试错法仍然是中药分析实验室在选择展开剂时最常用的方法（包括借鉴他人的经验）展开剂的优化主要考虑两方面：溶剂的极性和溶剂的选择性。前者要求使待分离的主要物质的Rf值在0.3~0.7之间；当Rf值符合要求后，进行等强度溶剂替换，直到分离度达到要求为止。对于硅胶等吸附薄层和正相分配色谱来说，展开剂的极性越大，溶剂强度就越大，洗脱能力就越强，即同一物质在薄层板上的Rf值越大。根据文献和样品所含化合物类型选择，并记录色谱纯溶剂→增减溶剂强度→混合，改性试剂，添加酸碱、水等→获得最佳配比常用溶剂的极性顺序水（最大）＞甲酰胺＞乙腈＞甲醇＞乙醇＞丙醇＞丙酮＞二氧六环＞四氢呋喃＞甲乙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞异丙醚＞二氯甲烷＞三氯甲烷＞溴乙烷＞笨＞四氯化碳＞二硫化碳＞环己烷＞己烷＞煤油（最小）展开-展开距离是不是展距越大越好呢？TLC:12-15cmHPTLC:5-7cm建议对展距进行考察，选择最佳展距，并做好记录温度对薄层色谱的影响一般而言，温度越低，Rf值越低；展开温度对薄层色谱的影响不大，一般相差±5℃时，Rf值的变动一般不会超过±0.02；因此，展开温度一般控制在15~25℃之间即可（一般空调实验室均能解决）；记录试验时的实际温度。相对湿度对薄层色谱的影响一般而言，湿度越低，Rf值越低；相对湿度是影响薄层色谱重现性差的主要原因之一；不同样品或成分和所选用的展开剂对相对湿度的适应能力不同；因此，建议展开的湿度一般控制在＜50%记录试验时实际的相对湿度相对湿度的控制方法相对湿度（%）所需硫酸浓度（V/V）硫酸（ml）水（ml）1810095.53268100425710047501005839.510065341007227.51008810.8100显色对同一薄层板在UV254、365nm、可见光（衍生前和/或后）下观察——给出丰富的化学结构类型信息；TLC板上常含有UV指示剂（F-254），在UV254nm激发下产生有色荧光。对UV254nm有吸收的物质存在于斑点上时发射的荧光会减弱（荧光淬灭）；喷雾优点：快速、方便、试剂消耗少；缺点：会产生有毒雾气，重现性是个问题。浸渍优点：显色均匀缺点：试剂消耗量大，产生溶剂线，背景染色深；显色剂考察对显色剂考察原则：用对照品对照的样品，通常选用针对对照品的专属性显色剂，如生物碱类药材，选用改良碘化铋钾试液；用对照药材对照的样品，通常选用显色剂如10%硫酸乙醇溶液显色；或选用针对该样品活性成分或专属性成分的专属性显色剂。加热显色者须注意加热的时间和温度（做好时间和温度的记录）有的成分加试剂后，如挥发油成分经香草醛硫酸显色，加热温度和时间长短不同或放置时间不同均可能使斑点的显色有所改变。检视分析结果采用相机或薄层色谱数码成像系统（C