杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白

Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白蛋白组吴召慧211-5-10主要内容：1.杆状病毒表达载体系统简介2.基本原理3.主要操作流程1：杆状病毒表达载体系统简介杆状病毒表达系统（Baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一个重组蛋白生产系统。杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV）表达系统和家蚕核型多角体病毒（Bombyxmorinuclearpolyhedrosisivirus,BmNPV）表达系统。杆状病毒科分为包含体病毒亚科（Eubaculovirinae）和非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae），包含体病毒亚科分为核型多角体病毒属（NPV）和颗粒体病毒属（GV）杆状病毒表达系统的优缺点优点对外源基因容量大适合表达细胞毒性蛋白安全性且表达产量高后加工过程完全可以同时表达多个外源基因体内表达缺点瞬时表达糖基化简单2：基本原理1：目的基因插入转移载体。2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯化获得重组病毒。3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。4：纯化目的蛋白杆状病毒表达载体的构建转移载体通常由三部分组成：E.coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保证转移载体能在大肠杆菌中扩增。含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下插入要表达的外源基因。启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA序列，用于与野生病毒DNA同源重组。直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困难，为纯化常采用下列方法：(1)在外源基因的前端插入6×His，表达的融合蛋白可通过Ni柱进行亲和层析纯化。(2)将谷胱甘肽转移酶基因（GST）导入外源基因前端，利用GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。(3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。Bac–to–Bac系统重组病毒的构建和基因的表达3：主要操作流程DH10Bactem.coli感受态细胞的制备转化DH10Bactem.coli提取重组病毒Sf9细胞转染，复制重组病毒生产重组蛋白DH10Bactem.coli感受态细胞的制备1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3μl50mg/ml卡那霉素（kan）和6μll5mg/ml四环素(tet)混匀；2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中，37℃,200rpm培养14-16h；3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml新鲜LB液体培养基【加100μlkan（50mg/ml）和200μltet（5mg/ml四环素）】，37℃,220rpm，约2h，至OD=0.4-0.6；4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管,冰浴20min，每5min摇动一次，同时冰浴上0.1MMgSO4,0.1MCaCl2+15%甘油；5.细菌液4℃，4500rpm，离心5min，弃上清；6.加10ml0.1MMgSO4重悬菌体，冰浴20min；7．4℃，4500rpm，离心5min，弃上清；8.加10ml0.1MCaCl2+15%甘油，重悬；9.200μl每管分装至1.5mltube管（-80℃预冷），-80℃保存。转化DH10BACTME.coli1.冰上融化DH10BACTME.coli感受态细胞（约5min）；2.取1ngpFastbac-重组质粒至DH10BACTME.coli感受态细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min；3.42℃热击45秒；立即转移至冰上冰浴2min；4.加800μl室温预热的LB培养基，37℃,220rpm，4h；5.涂布至LB琼脂平板（含Kan,Tet,Gen）,6.挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基（抗生素如上），37℃培养过夜。7.保种，提重组质粒重组病毒的提取(试剂盒）1用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清。2加入250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。3加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。4加入300μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。512,000rpm室温离心15min，收集上清。6加入800ul异丙醇，混匀至有沉淀出现。712,000rpm室温，离心15min，弃上清。8加入800ulbufferw2洗涤,12,000rpm室温离心1min，弃滤液。重复洗涤一次。9室温或风干DNA，加入50-80ulEluent溶液，冰上溶解10min，4℃保存。Sf9细胞转染1．37℃预热Sf900TM-IIISFM培养基；2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a．溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μlSf900TM-IIISFM培养基；b．转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μlSf900TM-IIISFM培养基，混匀；c．将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min；3．Sf9细胞计数,取6孔板，每孔加入1.6×106个细胞(其中一孔设为空白对照)，补加预热的Sf900TM-IIISFM培养基至2ml，混匀，室温静置15min，使细胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度，观察是否符合需求量）4．重组质粒与转染剂混合液加至六孔板，记录质粒名称；5．27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。6.离心，收集上清，保存病毒，细胞沉淀加lysisbuffer做Western-blot检测是否有目的蛋白。生产重组蛋白1.将转染过程收集的病毒加入sf9细胞；按以下公式计算所需病毒体积：Inoculumrequired(ml)=MOI(pfu/cell)×numberofcells/titerofviralstock(pfu/ml)2.收集细胞液，600rpm，离心5min，上清避光保存，细胞沉淀加Lysisbuffer重悬；3.超声破碎：200HZ，破碎15s，间歇30s,3个循环；4.离心：4℃，15000rpm，30min，0.45μm过滤器过滤上清，得Lysate；5.根据所带标签纯化重组蛋白