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0分子生物学实验报告题目：目的基因原核表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达班级：生技1301姓名:陈绵辉学号:13110703013指导教师：孟春晓实验时间：2016.5.28-2016.5.311目的基因原核表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达引言：宿主的相关背景：大肠杆菌DH5α是一种诱变菌株，主要表现为对外源DNA的免疫缺乏，用于基因工程的菌种相比于正常菌株缺少了一定的免疫机制。DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，普通的大肠杆菌细胞内有一种“免疫”机制，即当外源DNA侵入时，会产生诸如限制性内切酶类的物质，将外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修饰（如甲基化）所以不被限制酶识别，不会被剪切。这样的菌是不能直接用于基因工程的，我们总不希望目的基因导入进去还来不及复制就被剪切掉。DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。Mˉ是指DH5α菌株缺乏DNA修饰，即其自身DNA不会被修饰。Rˉ是指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。AMPˉ是指其对氨苄青霉素敏感。DH5α菌株可以用于制作基因库等，除此之外，因其特性，可用作基因工程的受体菌。质粒的相关背景：pBV220质粒的SDsequence（用于结合原核生物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白。载体含有强的转录终止子可防止出现通读现象，有利于质粒-宿主系统的稳定。载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。pBV220含有PL启动子和编码对该启动子具有抑制作用而又对温度敏感的cI蛋白基因cIts857调控基因cI，因此可用温度对插入其中的外源基因的转录进行调控。温控型原核表达载体，高拷贝数，大容量，强启动子，强转录终止子，可在任何受体菌中诱导表达。pBV220载体是λPL/PR-cI857温度敏感系统表达载体，能够在42℃表达非融合的目的蛋白。在利用pBV220载体进行质粒构建的时候，需要加入ATG起始密码子。整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；温度诱导后外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%，产物以包含体形式存在、不易降解、均一性好。2实验主要流程：材料方法1材料与试剂1.1菌种：含质粒的大肠杆菌DH5α菌种、含pBV220质粒的大肠杆菌菌种1.2载体：pBV2201.3酶：Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶：ECORI、BamHI1.4目的基因:657bp目的蛋白：20KD菌种的纯化和培养质粒质粒酶切产物PCR扩增目的基因PCR产物回收（目的基因）目的基因酶切产物重组DNA克隆（单菌落）筛选的阳性克隆表达的目的基因碱法抽提质粒双酶切并回收回收双酶切并回收T4连接转化感受态的大肠杆菌菌体PCR鉴定诱导表达表达产物的鉴定31.5引物：一对（引物F和引物R）2主要仪器设备微量移液器（10ul200ul1000ul）Heraeμs离心机PTC-200型PCR仪DYY-8C电泳仪μVP凝胶成像系统KYQL-350×520FZ型小型压力蒸汽灭菌锅等3实验方法3.1质粒提取3.1.1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入30mlLB液体培养基（含Amp50μg\ml）中，37°振荡培养过夜。3.1.2.将菌液倒入1.5mlEP管中，8000rpm离心1min，去掉上清液，重复一次，小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀。3.1.3.沉淀悬于100μl溶液Ⅰ，涡旋振荡使其充分悬浮。3.1.4.加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，温和旋转EP管5次。冰上放置2min。当溶液逐渐由浑浊变为清亮时加溶液Ⅲ。3.1.5.加入150μl溶液Ⅲ，将EP管温和翻转2-3次（冰上放置10min，让质粒DNA复性）。3.1.6.12000rpm，离心10min，将上清移至1个新的1.5ml离心管中，注意所取体积，吸取时不可吸入底部的沉淀。3.1.7.加入等体积酚和氯仿：异丙醇溶液（24：1），各200ul，共400ul,混匀。12000rpm，4°C，离心10min，取上层上清液。3.1.8.上清液中加入预冷的等体积异丙醇，轻轻混匀，-40°C沉淀30min。3.1.9.12000rpm离心4min，去上清。风干沉淀。3.1.10.每管中加入20μl去离子水或TE缓冲液，37°C溶解质粒DNA。完全溶解后，-20°C保存。3.1.11.取样5μl，加入上样缓冲液，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。43.2PCR扩增目的基因PCR扩增体系：灭菌去离子水75μl10Xbμffer10μldNTP8μl引物F2μl引物R2μl模板2μlTaq酶1μl程序：1.94°C5min2.94°C50sec3.55°C50sec4.72°C50sec5.重复步骤2-436次6.72°C10min3.3产物回收将PCR产物留出5μl进行电泳检测，其余沉淀回收。加入1\10体积的3mol/LKAc和2倍体积无水乙醇，-40°C沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，风干。加入20μl去离子水溶解。3.4琼脂糖凝胶电泳检测DNA胶浓度：1.2％琼脂糖凝胶液上样量：6ul电泳条件：120V（实际只有86V）3.5感受态制备51.挑取平板上DH5α菌种接种于30mlLB培养液中，37°C培养过夜2.将0.3ml过夜培养菌接种于一个含有30mlLB培养基的300ml烧瓶中，37°C振荡培养1h（旋转摇床220r/min）（OD600约在0.2-0.4）。3.在无菌条件下将上述菌液转移到一个用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10min4.4°C下4000r/min离心10min，以回收细胞5．倒出培养液，将管中倒置1min以使最后残留的痕量残留的痕量培养液流尽6．用冰预冷的0.1mol/LCaCl210ml重悬细胞沉淀，放在冰上30min7.4°C下4000r/min离心10min，以回收细胞8.倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量流尽9.用1ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬细胞沉淀，将细胞分装成200μl的小份，此为感受态细胞。3.6目的基因和载体的酶切质粒酶切体系：质粒DNA30ul10xbuffer(Tango)3ulEcoRI1ulBamHI1ul去离子水5ulPCR产物酶切体系：PCR产物20ul10xbuffer3ulEcoRI和BamHI1ul去离子水5ul条件：37°C水浴酶切4h3.7DNA重组6连接体系：PCR酶切产物7ul质粒酶切产物1ul10xbuffer1ulT4DNA连接酶1ul条件：16°C连接5h。3.8转化热激转化法：将转化管轻轻摇匀，冰上放置30min,热激42°C水浴保温90S迅速冰浴2min立即向管中加入800ulLB培养基，37°C慢摇复苏培养1h。（150r/min）3.9重组子的鉴定菌体PCR体系：双蒸水231ul10Xbuffer30uldNTP24ul引物F6ul引物R6ulTaq酶3ul将上述混合液分为15管，每一管取19ul。各取1ul菌液作模板。3.10诱导表达鉴定后的阳性克隆，30°C培养到对数期，42°C诱导过夜进行蛋白质表达。73.11表达产物样品的处理诱导过夜的菌液和对照菌液各1.5mL加入离心管中，10000r/min离心1min,沉淀细胞，去上清，加50ul双蒸水使细胞悬浮，加入50ul2×上样缓冲液，沸水中加热10min。3.12SDS-PAGE检测目的蛋白胶浓度：12%分离胶，4%浓缩胶上样量：10ul电泳条件：浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V，直到溴酚蓝走至前沿为止结果与讨论1．质粒提取和目的基因扩增图一PCR扩增和质粒提取的电泳结果8图二PCR仪型号为：PTC-2001、橙色箭头所指为本人加的样，下面条带为质粒的电泳，上面条带为PCR的电泳，结果为质粒提取出来，但是PCR没有扩增成功；2、PCR没有成功的原因可能是Taq酶在加样的过程中由于操作不当而失活，导致结果失败；3、在PCR体系中加入一定量的矿物油，以防止在PCR过程中的因为高温而使体系水分蒸发导致结果失败；4、其实在做的过程中，可以将PCR循环数调至30次也是足够的了；5、质粒提取中的溶液Ⅱ应该现配先用，因为NaOH和SDS会发生沉淀作用；6、NaOH的作用是将DNA变性，而SDS则是将细胞壁破碎；7、溶液Ⅲ主要是使得变性的DNA复性。2.酶切回收1、酶切回收产物应该彻底的风干，以防止其中的有机溶剂对下一步的造作造成影响；2、在-40℃沉淀时，可以适当的延长时间，保证回收的更加充分。93.转化图三转化后细胞在固体培养基上过夜培养后的情况1、图中的菌落数太多，可能是氨苄青霉素已经失效，对菌落没有筛选作用了；2、热激时间为精确的90S，在42℃水中；3、之后应该迅速冰浴2min，菌体将会发生细胞膜的破裂，因而质粒可以转化进去；4、之后将菌在37℃中培养1小时，缓慢摇床，防止菌体的损伤；5、酶切体系和链接体系中，应该先加入体积较大的组分，再加比较少的组分；6、连接培养条件为16℃，16小时。7、在培养基上长出了很多的菌落，说明载体的构建和转入细胞是成功的。10图五恒温循环仪1、在连接质粒和目的基因时，应该控制时间为16h最好，温度为16℃，但是由于时间问题我们只连接了5h。4.重组子的鉴定图四重组子的电泳鉴定图1、由图可以得出结论：重组质粒只有一小部分成功；2、利用PCR法鉴定重组子，其出错的概率很低；3、重组子的鉴定还有限制性酶切法，结果鉴定方法：若是连接成功，则是电泳11为两条带，若是不成功，则是只有一条带。5.目的蛋白的诱导表达和表达产物检测图六目的蛋白鉴定电泳图1、图中的橙色箭头所指为本人添加的蛋白质样品；2、目的蛋白的表达量不高，但是还是有的；3、利用SDS-PAGE进行蛋白质的鉴定，是目前最好的鉴定方法之一；4、胶的制备包括12%分离胶和4%的浓缩胶，先加分离胶，再在上部加上浓缩胶；5、需要注意分离胶和浓缩胶的电压不一样；6、丙烯酰胺是有毒物质，使用时需要注意。结论1、载体的构建成功了一小部分，以至于实验可以继续进行2、目的蛋白的表达量虽然不高，但是还是可以检测到的参考文献刘文，孟春晓，盛桂华.分子生物学实验指导.山东理工大学生命科学学院，2016.2~82收获与建议分子生物学作为生命研究领域最重要的一个学科，从一开始的理论学习到实验的进行都是倾注了很多的心血。不仅仅是因为分子生物学是我要考研的学科之一，更是因为在未来的生命科学发展中它是一颗闪亮的新星，亦是未来研究领域12的热点之一。经过四天的实验，我惊讶的发现，对于这种相对而言比较枯燥的实验过程我的接受能力还是很强的，以至于开始喜欢上了这种感觉。穿着实验服，手拿着移液器，将一种种试剂精确到微升的加入到各个反应体系中，感觉还是很棒的。实验中，因为分子生物学是一个相对比较精准的实验性科学，所以对于实验的精度要求还是很高的，比如在加样时需要一只手去托住另一只手的手腕才能将其准确地加进体系中。生命科学是一门需要依据于实验而进行的学科。以前在做第二课堂时所学的一些关于DNA的提取，PCR，电泳等，这一次做实验竟然发现忘得差不多了，虽然在理论课上不止一次的提起如何做实验，但是实践还是有很大的不同的，不仅仅是各种意外的出现更有运气的成分。孟老师也说过，实验过程中会有很多不可言喻的事情发生，时而好时而失败。实验时间为四天，不长也不短，从开始的紧张和陌生以至于不知所措，到最后的相对轻松，各种等待，对于整个实验的把握情况也有了大幅度的提升，我想这不仅仅是实验技能的提升，更是一种内心上的强大（从陌生到熟悉）。但是实验之中还不免暴露出很多的缺点和值得批评的地方。比如，实验中存在侥幸心理，没有严格按照老师的要求去做试验，或许也是一些实验失败的原因吧。整个实验下来，我觉得最好还是每一个人都可以将所有的步骤都亲自做一遍，只有这样才可以增加对于实验的理解和掌握，才能达到实验的目的。但是实验的过程中很多人只是一个配角的角色，并没有将自己带入到实验