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第一章生物反应器（Bioreactor）第一节概述传统生物工业中使用的生物反应器称为“发酵罐”（fermenter）。20世纪70年代，Atkinson提出了生化反应器（biochemicalreactor）一词，其含义除包括原有发酵罐外，还包括酶反应器、处理废水用反应器等。与此同时，Ollis提出了另一术语－生物反应器（biologicalreactor）。进入80年代，生物反应器（bioreactor）一词在专业期刊与书籍中大量出现。生物反应器生物反应器细胞培养液（养分）蛋白质、疫苗…组织…转基因动物是指通过实验方法，人工地把外源基因导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使外源基因与动物本身的基因组整合在一起，因而外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。1982年，R.D.Palmiter等科学家将金属硫蛋白基因的启动子和大白鼠生长激素基因拼接成融合基因，把这种基因导入小白鼠的受精卵，再将这一受精卵移植到一借腹怀孕的母鼠体内，生下来的小鼠比正常小鼠体格大一倍，称为“巨鼠”。在经济效益方面，应用转基因动物—乳腺生物反应器技术来制造基因药物也是一种可以获取巨额经济利润的新型产业。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有a—抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的a—抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。研究生物反应器的目的要确定为达到一定的生产目的需要多大的生物反应器，什么样的结构更好；对已有的生物反应器进行分析，达到优化的目的；分析各种生物反应器的数据，从而对细胞的生长、代谢等过程有更深入的理解。第二节细胞生长及代谢过程动力学一、细胞生长的特点、描述方法的分类（1）反应速率：单位时间物质浓度的变化量。（2）得率系数：两种物质得失之间的计量比。（3）比速率：单位浓度的菌体单位时间引起某物质浓度的变化量。注意：在作动力学分析时比速率的概念是很重要的，它表示菌体活力的大小，能力的大小。（4）理想流动与非理想流动在研究小型反应器时根据其流动特点分为两种理想流动模式：一、全混式：反应器内各点浓度及其他条件均一；二、活塞流式：反应器内物质沿一定方向流动，完全没有反向混合。（5）细胞生长的特点及细胞群体的描述细胞的生长（繁殖）、代谢是一个复杂的生物化学过程，既包含有各种细胞内的生化反应，胞内与胞外的物质交换也包含有胞外的物质传递及生化反应。这个反应体系的特点是它是一种多相、多组分、非线性的体系。多相：体系内常含有气相、液相以及菌体（固）相。多组分：在培养液中有各种营养成分。非线性：细胞的代谢过程通常不能用线性方程或方程组来描述，即使简化模型中的参数也常具有时变性。对这样复杂的体系进行描述几乎是不可能的。通常对细胞群体所进行简化假设是否考虑细胞内部复杂的结构？是否考虑细胞之间的差别？根据上述两方面的考虑，对细胞群体可以有4种模型。在工程上应用最多的是非结构非离散模型，通常简称均衡生长模型。特点：不考虑细胞内部的结构（组分），又不考虑各种细胞之间有任何差异，因此可以把细胞用“浓度”这一个量来描述，即把细胞看成一种“溶质”，从而简化了胞内外的传递过程分析，也简化了过程的数学描述。二、细胞浓度及其测量1.直接测定法2.间接测定法1.直接测定法（1）细胞干重法:把一定体积的培养液离心、收集细胞、洗涤、干燥、称重。（2）显微计数法：利用显微镜和血球计数器测定单位体积培养液中的细胞个数。（3）平板计数法：将微生物培养液样品用无菌生理盐水进行一系列的稀释（通常每次稀释一个数量级），取一定量的稀释液均匀涂布在培养皿中的固体平板培养基上，经一段时间的培养，从平板上长出的菌落数、涂布的稀释液体积以及稀释倍数可以算出原培养液中的微生物浓度。（4）浊度法：培养液的浊度或光密度与细胞浓度成正比，因而可通过比色测定培养液中的细胞浓度。2.间接测定法从图中可以看出，DNA含量的变化最小。培养基中存在较多不溶性物质时，可以通过测定构成细胞的大分子物质（如蛋白质、RNA、DNA等)来确定细胞浓度。采用这种方法来估计细胞浓度时，须确定在培养过程中，这种组分在细胞中的含量基本保持不变。第三节生物反应器的基本类型及其设计生物反应器的定义生物反应器就是为适应生物反应的特点而设计的反应设备。而所谓生物反应则是由各种不同的或一系列的生物催化剂——酶在各种不同条件下催化的一个或一系列的反应，从本质上说都是酶反应，故生物反应器实质上就是酶反应器。因为历史原因，人们往常将适合于利用生长的和非固定化的细胞进行反应的生物反应器称为发酵罐、其余各类称为酶反应器。国外有学者认为，生物反应器不同于传统发酵罐的一个要点是“新”，就是指采用固定化生物催化剂（无论酶或细胞、组织）的反应器。国内有权威人士提出，生物反应器即是酶反应器、微生物反应器（发酵罐）和动植物细胞培养用反应器的统称。NewBrunswickScientificCo.,Inc.(American,NBSCo.)BiostatB2BiostatED10PilotBiostatUD50各类生物反应器机械搅拌式反应器气升式反应器鼓泡反应器膜生物反应器固定床和流化床反应器1.机械搅拌式反应器优点：适用性好，适应性强，从小型到中型、到大型的细胞培养过程都可以用，放大容易。缺点：罐内的机械搅拌剪切力容易损伤娇嫩的细胞，造成某些细胞培养过程减产机械搅拌式反应器2.气升式反应器优点：反应器内整体混合均匀，而且因不用机械搅拌桨，减少了剪切作用对细胞的伤害。由于液体循环流动速度较快，因此反应器内供氧及传感都较好。缺点：较高（从十几米到几十米高），因而空气压缩机出口的压力较高。对反应器设计要求较高，外循环困难。气体提升式发酵罐生物反应器还可以按其操作方式分为以下3类批式培养连续培养半连续操作批式培养营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。优点：操作较容易缺点：从细胞所处的化学环境来看，则明显改变，培养初期营养物过多可能抑制生长，培养的中后期可能又因为营养物浓度过低而降低培养效率。从细胞的增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，当营养物浓度过低也长不快，总的设备生长能力较低。连续培养不断地向反应器中加入营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。实际进行连续培养有两类反应器：搅拌罐式反应器（恒化器）管式反应器半连续培养介于批式与连续操作之间两种方式：补料批式或流加过程（常用）：在批式培养过程中不断补入营养物，以解决营养物的抑制及不足问题。在补料的同时间断地采出一定量的发酵液体产物，延长发酵培养周期，发酵周期常常由于菌体的老化而结束。第四节生物反应器的放大生物反应器的放大是指在反应器的设计与操作上，将小型反应器中的最优反应结果转移至工业规模生物反应器中重现的过程。传统上生物反应过程的开发，通常经历实验室小型试验、中间试验和工厂化规模放大的3个阶段。小型试验阶段主要任务是根据酶或细胞的生物学特性和催化能力，研究生物反应的规律，选择合理的反应器型式，确定其最优操作方式和操作条件。此阶段的试验常在1～50L的实验室反应器中进行。中间试验（中试）试验的重点是检验小型试验得出的最优设计方案的可靠性，研究反应器几何尺度对反应器操作性能的影响，之后对设计方案进行一定的修正，并提出工业规模反应器的设计与操作条件。中试研究一般在50～1000L的反应器中完成。工厂化规模放大一般是在完成设计工作后进行一段时间的试验生产，最终建立合理的工艺条件。在上述3个阶段的不同大小的反应器中进行相同的生物反应时，由于规模的不同，生物反应器的流体流动与动量传递、热量传递和质量传递特性存在差异，有可能导致在生产反应器上不能达到实验室反应器的最优反应结果。如何通过估计不同规模生物反应器中的过程状态，对放大的反应器进行合理配置，使其进行的反应过程与实验反应器的细胞生长与代谢过程相似，这就是生物反应器放大的基本任务。成功放大的例子中国维生素C的两步发酵过程正在使用单台容量为200～300m3的气升式反应器；国际上乙酸生产的塔式反应器单台容量已达到1000m3；酵母单细胞蛋白的单台塔式反应器容量达到2000m3。一、概述1.氧的供给在发酵过程中，氧是如何得到供应的呢？实验得知，在深层培养中菌体摄取的是溶解的氧，即气相的氧先溶在发酵液中再传递给菌体。根据化工原理得知氧从气泡传给发酵液的速率：2.罐内流体的混合罐内流体的混合一方面是为了加强氧的传递，另一方面使流体混合均匀避免局部过浓或过稀的现象并强化菌体与营养物的接触。显然混合时间短些好。在反应器放大时混合时间往往要要加长．通常小罐的混合时间仅为几秒，而大罐的混合时间往往需要几十秒以至分钟级。二、搅拌及传氧1.搅拌层流和湍流流体流动两种流型－层流和湍流层流层流时圆管截面上的速度呈抛物线分布，如下图所示。湍流湍流时流体质点在沿管轴流动的同时还作着随机的脉动，空间任意一点的速度（包括方向和大小）都随时变化。反应器搅拌的一个重要的参数是通过搅拌器输入到流体的功率值。在低速搅拌下，流体呈层流，消耗功率少；在高速搅拌下，流体呈湍流，混合好，消耗功率也增加；层流和湍流中间还有一过渡流区。牛顿粘性定律假设从流动的流体中取出相邻的两层流体，设其面积为A，上层流体的速度为u+du，下层的流体速度为u,它们的相对速度即为du。两流体层之间的垂直距离为dy。可由证明：对大多数流体，两流体层之间的内摩擦力F与层间的接触面积A，相对速度du成正比，与两流体层间的垂直距离dy成反比。牛顿型流体和非牛顿型流体服从此定律的流体称为牛顿型流体。所有气体和大多数液体都属于这一类；不服从牛顿粘性定律的称为非牛顿型流体。如某些高分子溶液，胶体溶液、泥浆都属于这一类。一般细菌、酵母在低浓度下为牛顿型流体，丝状菌或高密度培养时发酵液呈非牛顿型流体性质。研究搅拌功率往往从最简单的情况开始：先研究牛顿型流体不通气时功耗Po，再研究牛顿型流体通气时功耗Pg，再研究非牛顿型流体不通气及通气时的功耗。2.氧的传递前面已讲过，氧的传递能力的好坏是由kLα（传氧系数）来衡量的，它受流体物性、反应器尺寸、操作条件等各方面的影响。氧的传递又常限制细胞的生长，所以这里我们先研究一下摇瓶培养中的传氧，再研究发酵罐中的传氧。氧的传递除受流体物性的影响外，主要受摇动频率(r／min)、装料体积及有无档板的影响，下表给出用亚硫酸钠溶液测得的传氧系数、供氧速率(OTR)与各因素的关系。(1)摇瓶培养中的传氧由表中数据看出体积增加、频率下降及无挡板对传氧都是不利的，实验室数据在放大成罐操作时还是很有参考价值的。(2)搅拌罐中的传氧系数kLα搅拌罐中的传氧系数与体系的特性、罐及搅拌桨的几何尺寸、操作参数等有关，不少研究者得出了许多关联式，因所用的罐体系和几何尺寸不同得到的式子有些是矛盾的。下面只介绍几个文献上常引用的关联式。三、生物反应器的放大原则1．几何相似2．恒定等体积功率放大3．恒定传氧系数kLα放大4.恒定剪切力恒定叶端速度(πndi)放大5.恒定的混合时间tM放大1．几何相似按小的与大的装置各部几何尺寸比例大致相同放大2．恒定等体积功率放大3．恒定传氧系数kLα放大4.恒定剪切力恒定叶端速度(πndi)放大5.恒定的混合时间tM放大第五节生物反应器的控制及优化一、生物反应器的控制生物反应器控制的目的是在实际发酵过程中实现在工艺和动力学等研究中得到的工艺条件。最常用的基本变量及其调节方法见下表。常用的控制方法是反馈调节注意：测量装置的探头及执行器一般要与培养液接触。根据生物培养的特点对它们有以下特殊的要求：（1)能灭菌，无泄漏，以保证纯种培养；(2)长时间稳定