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RNA甲基化与MeRIP-Seq测序技术——甲基化DNA免疫共沉淀技术（MeDIP）、RNA结合蛋白免疫共沉淀技术（RIP）和RNA测序技术（RNA-seq）12目录一、探究与技术—研究历程（方法：使用关键词“MeRIP”在NCBI上检索到21篇相关文献，形成综述）3~8页二、探究与技术—服务历程（方法：找到并查看提供此类服务的三家公司，发布服务的思路与消息）9~9页三、研究与技术服务意义（方法：综合学术界发展势态与技术服务发展势态）10~10页四、实验原理与本质—Peak峰出现的原理（方法：综合NCBI上检索到21篇文献中的相关技术言论，着重解释了实验原理与Peak峰出现的原理）11~12页五、MeRIP-Seq测序实验简易流程（方法：深入浅出，用简单的流程描述本技术）13~13页六、北京基因组研究所流程与上海晶能生物流程（方法：找出关键技术文献两篇，详细对比实验方法和技术路线）14~14页提示，晶能生物在NCBI上有署名文献七、MeRIP-Seq可行性报告与方案15~17页（方法：综合MeDIP-Seq技术、RNA-Seq技术、m6A成熟抗体技术、mRNA成熟片段化技术提出“定量化”的执行方案）八、采购试剂方案（方法：找出必要的2~4类试剂的采购供应情况，均有代理商！）18~18页九、目前我国甲基化诊断产品注册情况20~21页（方法：在CFNA官方网站上已经可以检索到一例甲基化诊断试剂盒（PCR荧光探针法））探究与技术MeRIP-Seq测序技术甲基化转录组RNA免疫共沉淀—高通量测序技术（MethylatedRNAImmunoprecipitationSequencing）研究历程分析方法：以关键词“MeRIP”在NCBI上检索文献，共检索到21篇文献，按照时间顺序查看文献研究流程。1、2012年，康奈尔大学威尔医学院提出MeRIP-Seq测序技术，就是指全转录组m6A定位的方法，即结合m6A特异性甲基化RNA免疫沉淀技术与新一代测序技术的结合（MeRIPSeq）。一、抗体的制备方法：anti-m6A抗体（来自文献1987/2011/1977）二、建库样本类型：m6A在RNA定位于成熟的mRNA中，而不在PolyA尾部。三、数据统计分析类型：Peak检测峰的分布、Peak（检测峰）统计分析与可视化、检测峰中motif基序统计分析与可视化等。提示：大量的m6A存在于细胞0.1–0.4%的总RNA腺苷残基中，这表明这种修饰在转录组可能普遍存在。虽然m6A发现于许多年前，但是在基于m6A修饰mRNA引发的病患研究进展缓慢。这在很大程度上是因为缺乏可用的检测m6A的方法。因为甲基腺苷不会改变其与胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基结合的能力，m6A也不适用于标准的杂交或测序的检测技术。Cell.2012Jun22;149(7):1635-46.32、2013年，中国科学院北京基因组研究所提出MeRIP-Seq改进测序数据分析方法，就是指有效识别m6A修饰区域，并且统计分析和可视化测序数据。一、m6A峰在RNA不同区域分布的饼状图。二、m6A峰在RNA三类区域分布的百分率。三、m6A位点在特定转录本序列中的位置。提示：文章中的分析方法MeRIP—PF可以实现了m6A信号或检测峰的基因注释，结果可以Excel和图形格式输出，有利于研究的进一步开展。MeRIP—PF在Perl上完成，并且可从的免费获得。GenomicsProteomicsBioinformatics.2013Feb;11(1):72-5.43、2014年，西安交大利物浦大学生物科学系和西北工业大学开发RNA甲基化差异分析软件包，就是指MeRIP-Seq测序数据分析软件、原序列比对、RNA甲基化位点检测、模体序列发现、RNA差异甲基化分析和功能分析。2015年，西安交大利物浦大学生物科学系和西北工业大学在中国《生物化学与生物物理进展》上发表名为《高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展》的综述文章。提示：MeRIP-Seq测序技术还处于非常早期发展阶段。文章讨论了每个处理步骤背后的基本原理，以及具体实践方法和可能的替代策略，并且exomepeakR/Bioconductor包是免费提供，参见。Methods.2014Oct1;69(3):274-81.4、2014年，中国科学院北京基因组研究所研究了模式植物水稻全转录组RNA甲基化（愈伤组织Vs叶片）特点，就是指甲基化位点的分布特点、甲基化与表达量的关系、组织表达差异统计分析、甲基化富集GO功能差异分析。一、m6A峰在RNA三类区域分布的百分率。二、m6A位点在特定转录本序列中的位置。三、甲基化富集GO功能差异分析。RNABiol.2014Sep;11(9):1180–1188.5(B)GOanalysisofcommonlymethylatedgenes(CM)andselectivelymethylatedgenesincallus(CS)andleaf(LS).GO功能分析常见甲基化基因（CM）与选择性甲基化基因在愈伤组织（CS）和叶片（LS）中的表达可视化图。RNABiol.2014;11(9):1180-8.提示：可以说自此（2015年初）后，MeRIP-Seq测序技术发展模式基本确定，就是采用MeRIP-Seq测序技术研究模式物种，然后在整体水平上做mRNA中m6A位点的分布和特定位点做表达量、甲基化位点的确定，还有组织差异和条件差异的GO功能分析等。65、2015年，西北工业大学继续讨论和研究RNA甲基化和去甲基化酶，收集数据进行荟萃分析，从系统水平寻找共同的甲基化调节方式。MolBiosyst.2015Jan;11(1):262-74.6、2015年，西安交通大学利物浦和中国矿业大学继续讨论和研究开展RNA甲基化数据库的建设，提示RNA甲基化领域的发展潜力。NucleicAcidsRes.2015Jan;43(Databaseissue):D197-203.7、2015、2017年，芝加哥大学化学系、生物化学与分子生物学系从RNA交联和免疫共沉淀和MeRIP技术出发开展研究m6A的分子开关作用，提示作者绘制了大量相关性和对比类的图形；2017研究识别m6A位点的蛋白。Nature.2015Feb26;518(7540):560-4.Methods.2017Aug15;126:105-111.8、2015年，西安交大利物浦大学生物科学系继续讨论和研究开发了基于HMM隐马尔可夫模型的峰识别寻峰算法，意在寻找更好的寻峰算法。BMCGenomics.2015;16Suppl4:S2.9、2015、2016、2016、2017.8年，西北工业大学、西安交大利物浦大学、麻省理工学院、扬州大学继续讨论和研究基于HMM隐马尔可夫模型的差异甲基化区域分辨、病例-对照差异甲基化问题、基因注释问题、精确预测mRNA甲基化位置；差异甲基化分析。BiomedResInt.2015;2015:852070.AnalBiochem.2016Apr15;499:15-23.BiomedResInt.2016;2016:8367534.Bioinformatics.2016Jun15;32(12):i378-i385.BMCGenomics.2016Aug22;17Suppl7:520.BMCBioinformatics.2017Aug31;18(1):387.10、2017年，奥地利因斯布鲁克医科大学从另一个甲基化位点m5C角度研究RNA甲基化并且对比和m6A的关系。技术路线：按照重亚硫酸盐测序（BS-Seq）的思路进行，可以实现C到U的转变，进而实现全转录组测序分析。GenomeBiol.2017Jan5;18(1):1.11、2017年，四川农业大学和晶能生物采用公司服务的方式研究了猪肌肉和脂肪组织m6A甲基化谱，完成了多种数据分析统计：整体水平上做mRNA中m6A位点的分布和特定位点做表达量、甲基化位点的确定，还有组织差异和条件差异的GO功能分析等。BMCGenomics.2017;18:336.Publishedonline2017Apr28.712、2017年8月，宾夕法尼亚大学细胞和分子生物学研究生院发表综述论文《鉴赏表观转录组epitranscriptome：新技术和新观点》。Enzymes.2017;41:269-298.Epub2017Apr14.13、2017年9月，中国科学院动物研究所研究了斑马鱼造血干细胞和祖细胞m6A甲基化谱，又一次完成MeRIP-Seq技术的应用。Nature.2017Sep14;549(7671):273-276.Epub2017Sep6.14、2018年1月，中山大学肿瘤防治中心、中国南方地区肿瘤学国家重点实验室和国防科技大学提出研究m6A甲基化RNA位点变异的重要意义。提出：最近，N6-甲基腺嘌呤（m6A）已成为研究的热点，在许多基出生物学过程和各类疾病中起到关键作用。NucleicAcidsRes.2018Jan4;46(D1):D139-D145.15、2017年12月，香港大学医学院肝脏研究和病理区国家重点实验室使用转录组测序技术，m6A-Seq（MeRIP-Seq）和MeRIPqRT-PCR的方法共同检测目标基因的m6A修饰；提出：近年来，RNA的多样性和可逆性化学修饰成为一种新的表观遗传调控。Hepatology.2017Nov24.拿到的两篇文献——1、2014年，芝加哥大学化学系和生物物理学研究所发表综述文章《由可逆m6A甲基化RNA介导基因表达调控机制》，文中这种“RNA的化学标记”调剂机制中的相关蛋白被描述为“橡皮擦”、“阅读者”和“书写者”，以及mRNA的动态特征；提示：m6A甲基化RNA研究的重要意义。NatRevGenet.2014May;15(5):293-306.2、2016年，耶鲁大学医学院遗传学系和耶鲁干细胞中心研究了哺乳动物小鼠胚胎干细胞中m6A的DNA甲基化谱。提示：研究组研究的主题是m6A的DNA甲基化谱，对m6A的RNA甲基化的研究思路有指导作用。Nature.2016Apr21;532(7599):329-33.8服务历程三家企业2016~2017年相继推出RNA甲基化服务（MeRIP-Seq服务）—广州表观生物（成立于2016年11月）、广州锐博生物（成立于2004年“千人计划”专家张必良博士）和武汉生命之美（成立于2010年7月）。上海晶能生物合作过相关服务2017年4月。1、广州表观生物一、2017年9月，RNA甲基化（m6A）免疫共沉淀高通量测序（MeRIP-seq）服务方案。含基本分析内容：原始数据处理及统计、过滤后数据质量QC图、测序序列与参考基因组比对、基因组覆盖度分布。PeakCalling分析、Peak可视化、Peak统计分析、m6A的基本特征（peak在基因元件的分布、reads在基因元件的分布、Peak关联基因的特征）、差异peak分析、motif分析。没有GO功能分析。二、样本要求—物种信息（仅限人、大小鼠物种，其他物种需评估）；实验样本：细胞、组织、提取后的总RNA（限定有参基因组物种）三、方案思路：实验分组设置：细胞模型实验组VS对照组，建议3:3；组织模型正常组VS疾病组，建议5:5；组内对照：IP组VSinput组（input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合，是必备的组分）。测序模式：PE100/150，测序数据：3-6G。2、武汉生命之美一、方案思路：meRIP建库流程—meRIP分析流程（质量分析、peak分析、motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析）3、广州锐博生物一、服务特点:1.甲基化筛选范围广，全转录组范围筛查，通量高；2.丰富的项目经验，已与多家单位合作；3.项目周期快