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微生物检验基础杨杰明微生物基础1)微生物的定义2)微生物分类3)微生物的形态与结构4)微生物的形态与结构检查法1)微生物的定义微生物：是一群个体微小、结构简单、肉眼不能直接看到，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大几百、几千甚至几万倍才能看到的微小生物。包括：病毒、细菌、放线菌、螺旋体、立克次体、支原体、衣原体、真菌和原虫等。细菌:是一类个体微小、结构简单的原核细胞型微生物,无成形细胞核、也无核仁和核膜，除核蛋白体外无其他细胞器。微生物的分类微生物的常规分类：1、非细胞型微生物：病毒。（纳米）2、原核细胞型微生物：细菌（微米）放线菌、螺旋体、立克次体、支原体、衣原体等。3、真核细胞型微生物:真菌、原虫。微生物医学分类：1、正常菌群2、条件致病菌3、病原菌或称致病菌1.常见细菌的形态球菌(coccus)葡萄球菌(streptococcus)球菌(coccus)脑膜炎奈瑟菌双球菌(diplococcus)肺炎链球菌链球菌(streptococcus)球菌(coccus)球菌(coccus)八叠球菌(sarcina)杆菌(bacillus)不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。炭疽芽胞杆菌3-10μm大中大肠埃希菌2-3μm小布鲁菌0.6-1.5μm螺形菌(spiralbacterium)弧菌螺菌螺杆菌2.基本结构(1）细胞壁：主要功能、主要成分、革兰氏阴性菌和阳性菌的比较。（2）细胞膜:或称胞膜,细胞壁内侧，包绕在细菌胞浆外的具有弹性的半渗透性脂质双层生物膜。主要由磷脂及蛋白质构成.（3）细胞质：核蛋白体、质粒、胞质颗粒。（4）核质:或拟核是细菌的遗传物质，决定细菌的遗传特征1)细胞壁:是细菌细胞外层结构,一层较厚（5～80nm）、质量均匀的网状结构主要功能是维持菌体固有的外形,并保护细菌抵抗低渗环境.细胞壁主要成分为肽聚糖又称粘肽.肽聚糖为原核细胞型微生物所特有的物质和共同特征.根据细菌对革兰氏染色法反应,可将其分为革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌.而这两种细菌区别与其细胞壁的性质密切相关.革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁结构的比较特征:革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌强度:较坚韧较疏松厚度:厚，20～80nm薄，5～10nm肽聚糖层数:多，可达50层少，1～3层肽聚糖含量:多，可占胞壁干重50～80%少，占胞壁干重10～20%磷壁酸:+-外膜:-+结构:三维空间（立体结构）二维空间（平面结构）肽聚糖(peptidoglycan)革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥青霉素作用点溶菌酶作用点N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链肽聚糖(peptidoglycan)青霉素抗生素作用机理凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都能损伤细胞壁而使细菌变形或杀伤细菌青霉素和头孢菌素能与细菌竞争合成胞壁过程所需的转肽酶，抑制四肽侧链上D-丙氨酸与五肽桥之间的联结，使细菌不能合成完整的细胞壁，可导致细菌死亡。人和动物细胞无细胞壁结构，亦无肽聚糖，故溶菌酶和青霉素对人体细胞均无毒性作用。革兰阴性菌细胞壁的脂质双层结构，除了转运营养物质外，还有屏障作用，能阻止多种物质透过，抵抗许多化学药物的作用，所以革兰氏阴性菌对溶菌酶、青霉素等比革兰氏阳性具有较大的抵抗力.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构显著不同，导致这两类细菌在染色性、抗原性、毒性、对某些药物的敏感性等方面的很大差异。所以对临床标本涂片革兰氏染色初报告对临床感染选择性用药有一定的参考意义!维持菌体固有的形态保护细菌抵抗低渗环境参与菌体内外的物质交换菌体表面带有多种抗原分子，可诱发机体的免疫应答。细胞壁的功能细菌Ｌ型因缺乏完整的细胞壁，不能维持其固有的形态，呈现高度多形性，均为革兰染色阴性。在低渗的环境下，很容易吸水胀裂死亡，但在高渗环境中仍可生存和分裂繁殖。细胞壁缺陷型细菌称为细菌L型细菌细胞壁缺陷型或L型(bacterialLform)：细胞壁受损后仍能生长和分裂的细菌。在一般环境中不能耐受菌体内的高渗透压而将会涨破死亡。在高渗环境下，仍可存活。革兰阳性菌细胞壁缺失后，原生质仅被一层细胞膜包住——原生质体(protoplast)。革兰阴性菌肽聚糖层受损后尚有外膜保护——原生质球(spheroplast)。某些L型仍有一定的致病力，通常引起慢性感染。细菌细胞壁缺陷型（细菌L型）细菌L型呈高度多形性，大小不一。着色不匀，无论其原为革兰阳性或阴性菌，形成L型大多染成革兰阴性。细菌L型的形态和染色性蜡样芽胞杆菌L型的镜下形态（多形性）细菌L型生长缓慢，营养要求高，对渗透压敏感，普通营养基上不能生长，培养时必须用高渗的含血清的培养基。细菌L型在高渗的含血清的培养基上生长后形成三种类型的菌落。细菌L型的培养特性和菌落形态丝状菌落颗粒型菌落油煎蛋样菌（典型L型菌落）2)细胞膜细菌细胞膜的结构与真核细胞者基本相同，由磷脂和多种蛋白质组成，但不含胆固醇。细菌细胞膜的功能与真核细胞者类似，主要有物质转运、生物合成、分泌和呼吸等作用。细菌细胞膜可形成一种特有的结构，称为中介体。中介体：是部分细胞膜内陷、折叠、卷曲形成的囊状物，多见于革兰阳性菌。其功能类似于真核细胞的线粒体，故亦称为线粒体(chondroid)中介体核糖体：细菌合成蛋白质的场所，游离存在于蛋白质中。质粒：染色体外的遗传物质，存在于细胞质中。为闭合环状的双链DNA，控制细菌某些特定的遗传特性。细菌细胞质中含有多种颗粒，大多为贮藏的营养物质。其中有一种主要成分是RNA和多偏磷酸盐的颗粒，其嗜碱性强，用亚甲蓝染色时着色较深呈紫色，称为异染颗粒。常见于白喉棒状杆菌，位于菌体两端，故又称极体，有助于鉴定。3)细胞质4)核质:为细菌遗传物质中心细菌是原核细胞，不具有成形的核。细菌的遗传物质称为核质或拟核，无核膜、核仁和有丝分裂器。功能与真核细胞的染色体相似。核质由单一密闭环状DNA分子反复回旋卷曲盘绕组成松散网状结构。3.特殊结构（1）荚膜：抗原性、抗吞噬性、贮存水分。（2）鞭毛：抗原性（H抗原）、运动器官。（3）菌毛：普通菌毛和性菌毛。(粘附作用)（4）芽胞：强大的抵抗力。(灭菌效果指标)3.特殊结构3.1）荚膜(capsule)荚膜：某些细菌在其细胞壁外包绕一层黏液性物质，为疏水性多糖或蛋白质的多聚体，用理化方法去除后并不影响细胞的生命活动。肺炎链球菌荚膜荚膜抗吞噬作用：荚膜具有抵抗宿主吞噬细胞的作用，因而荚膜是病原菌的重要毒力因子。粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此之间粘连，也可粘附于组织细胞或无生命物体表面，形成生物膜，是引起感染的重要因素。抗有害物质的损伤作用：荚膜处于细胞的最外层，有保护菌体避免和减少受有害物质的损伤作用。荚膜的功能3.特殊结构3.2）鞭毛(flagellum)许多细菌在菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物，称为鞭毛，是细菌的运动器官。鞭毛需用电子显微镜观察，或经特殊染色法使鞭毛增粗后才能在光镜下看到。鞭毛菌分类单毛菌双毛菌丛毛菌周毛菌鞭毛是运动器官。鞭毛有抗原性。鞭毛的功能菌毛:许多革兰阴性菌和少数革兰阳性菌菌体表面存在着一种比鞭毛更细、更短而直硬的丝状物，与细菌的运动无关。菌毛蛋白具有抗原性。根据功能不同，菌毛可分为普通菌毛和性菌毛两类。菌毛在普通光学显微镜下看不到，必须用电子显微镜观察。3.特殊结构3.3）菌毛(filus/fimbriae)芽胞：某些细菌在一定的环境条件下，能在菌体内部形成一个圆形或卵圆形小体，是细菌的休眠形式。芽胞形成后细菌即失去繁殖能力。产生芽胞的都是革兰阳性菌。3.特殊结构3.4）芽胞(spore)细菌形成芽胞的能力是由菌体内的芽胞基因决定的。芽胞一般只在动物体外才能形成，其形成条件因菌种而异。一个细菌只形成一个芽胞，一个芽胞发芽也只生成一个菌体，细菌数量并未增加，因而芽胞不是细菌的繁殖方式。与芽胞相比，未形成芽胞而具有繁殖能力的菌体可称为繁殖体芽胞的形成与发芽芽胞的大小、形状、位置等随菌种而异，有重要的鉴别意义。炭疽芽胞杆菌肉毒梭菌破伤风梭菌芽胞的抵抗力强，可在自然界中存在多年，是重要的传染源。但芽胞并不直接引起疾病，只有发芽成为繁殖体后，才能迅速大量繁殖而致病。芽胞抵抗力强，故应以杀灭芽胞作为可靠的灭菌指标。芽胞抵抗力强的原因：(1)芽胞含水量少，蛋白质受热后不易变性。(2)芽胞具有多层致密的厚膜，理化因素不易透入。(3)含有的DAP与钙结合的盐能提高芽胞中各种酶的稳定性。芽胞的功能显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。染色法——细菌体小半透明，经染色后才能观察较清楚。4.细菌形态与结构检查法普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。普通光学显微镜显微镜放大法电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。电子显微镜肺炎链球菌荚膜荚膜显微镜放大法革兰染色法：结晶紫碘液95%乙醇复红染色法革兰阳性革兰阴性革兰氏染色原理细菌染色的机理尚未完全阐明,目前有多个学说包括:物理学说、化学学说、等电点学说、其他因素等。细菌革兰氏染色基本原理：1)细菌的等电点较低，约为PH2-5之间，细菌在中性、碱性及弱酸性环境中均带有阴电荷，易与带阳电荷的碱性梁料结合，因此在细菌学检验中常用碱性染料，如美蓝、结晶紫、碱性复红等。2)媒染液碘液进入菌体后与结晶紫结合,此结合又与革兰氏阳性菌体内的核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合.因此革兰氏阳性菌摄取结晶紫多而牢固,阴性菌缺乏核糖核酸镁盐,故对碘与结晶紫结合物摄取少而不牢固.3)菌膜的通透性不同.脱色液酒精容易透入革兰氏阴性菌体内,溶解染料和碘的结合物,使细菌脱色.而酒精不易透入革兰氏阳性菌体内,故不易脱色.革兰氏染色法的意义1）鉴别细菌2）选择有效药物3）与致病性相关染色法抗酸染色法石碳酸复红3%盐酸酒精美兰抗酸染色抗酸染色法原理抗酸菌体内含有脂类物质较多（高达40%）如结核分枝杆菌体内含有分枝菌酸，此物质具有抗酸的性质。染色时，它与石碳酸复红结合牢固，能抵抗酸性酒精的脱色作用，因而抗酸菌能保持复红的颜色。相反，非抗酸性的细菌体内含脂类少，易被酸性酒精脱色，脱色后又易从胞浆膜渗出，最后被美兰复染成蓝色。其他染色方法1.单染色法：美兰染色2.复染色法：革兰氏染色。3.特殊染色法：异染颗粒染色、鞭毛染色、芽胞染色、荚膜染色等。4.负染色法：墨汁染色5.荧光染色法：荧光染色法