实验十一-Southern杂交分析

11.植物基因组DNA的Southern杂交1、植物基因组DNA的提取与纯化2、植物基因组DNA的酶切3、酶切基因组DNA的凝胶电泳和Southernblotting4、探针序列的获得与标记5、探针与基因组DNA的杂交6、杂交信号的检测主要步骤一、Southernblotting（变性DNA转移到膜上）盐转：20×SSC为转移液，转移后DNA不能与尼龙膜共价结合，需要紫外交联。碱转：0.4MNaOH为转移液，转移后的DNA可直接与带正电荷的尼龙膜共价结合。带正电荷的尼龙膜分子量大于8kb的DNA分子，从凝胶转移到膜上的效率很低，所以需要把大片段DNA打断成较小的片段，以方便转移。紫外线照射打断大分子量DNA利用脱嘌呤方法打断DNA分子注：所有操作均需带手套进行！脱嘌呤方法的溶液配方及实验步骤脱嘌呤液中和液变性液0.25MHCl0.5MNaOH1.5MNaCl0.5MTris-HCl1.5MNaClPH7.5标准柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）0.3M柠檬酸三钠3MNaCl酶切基因组DNA的凝胶电泳1、配制0.8%或者1.0%的琼脂糖凝胶，注意胶的厚度和胶孔大小是否合适，在能满足需要的情况下，胶浓度越低、胶越薄越好。2、点样，基因组DNA酶切电泳一般用λ/HindIII作为DNA分子量标记。建议干点，即先加入与凝胶持平的新的电泳缓冲液，使胶孔里没有液体是点样，之后电泳至样品迁移出胶孔后添加电泳缓冲液至高于凝胶液面1-2mm。3、电泳：先用高电压使样品迁移出胶孔，再改用低电压（1-1.5V/cm）低电压过夜，至溴酚蓝到达凝胶下部1.5-2cm时停止电泳。4、凝胶照相，注意紫外照射时间越短越好；然后对凝胶进行修整，切去胶孔和边缘不含DNA的部分，注意保持边缘齐整，在凝胶正面的右上角切掉一小块以示方向，之后用记录凝胶的长和宽；凝胶处理过程中准备一块与凝胶相同大小的尼龙膜和两张滤纸，在尼龙膜的右上角剪掉一小块以示方向，如有需要，用铅笔在右下角写好编号。琼脂糖凝胶的处理1、若使用碱转法，可以直接将凝胶中大于8kb的部分置于紫外灯下照射10-15分钟后用于转膜。2、若使用盐转法，则按照脱嘌呤步骤进行凝胶的处理。盐转法脱嘌呤步骤1、用0.25M的HCl室温漂洗凝胶至溴酚蓝的蓝色变成黄色（约15min），50rpm；2、用灭菌的双蒸水洗掉凝胶表面的HCL溶液，漂洗5min；3、用变性液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm（使DNA变性），之后用蒸馏水漂洗凝胶；4、用中和液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm，之后用蒸馏水漂洗；5、在20×SSC中平衡凝胶10min，等待转膜。6、剪好的膜先用灭菌的蒸馏水润湿（膜漂浮在液面上），然后在2×SSC中平衡（膜可以没入溶液中）。滤纸用2×SSC润湿。滤纸桥凝胶尼龙膜吸水纸重物支撑架滤纸转移液毛细管转移Southern转膜过程1、找一块比凝胶大的平台（如大型的制胶板），放入适当的托盘中，加入20×SSC转移液。2、平台上铺一层比凝胶稍大的用20×SSC浸透的厚滤纸或2-3层普通滤纸，滤纸两头接触到托盘中的20×SSC溶液。滤纸和平台之间不能有气泡。。3、将凝胶正向放于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。4、用保鲜膜围绕凝胶周边，但不要覆盖凝胶，以此作为屏障，防止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中（液流“短路”现象是导致凝胶中的DNA的转移效率下降的主要原因）。5、切一叠（5-8cm高）与滤纸同等大小的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在上方放一块玻璃板，玻璃板上压重物，使DNA转移持续过夜（可转移5-8小时）。6、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，将湿润的尼龙膜直接进行紫外交联固定DNA到尼龙膜上。对转移后的凝胶，可在紫外透射仪上观察是否还有残留的DNA。转移方法和膜注意事项：1、凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题，EB也可以加入到样品中。2、所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验。3、根据我们的经验，用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。4、碱性转移（如在0.4MNaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker的转移。DNA的转移和固定如果你想采用那么紫外交联的方法（尼龙膜）将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后自然晾干后保存，也可以直接进入预杂交步骤。，烘烤（尼龙膜）在2×SSC简单的洗涤一下膜将尼龙膜放在120℃下烘烤30分钟或者根据操作说明的要求进行操作。，烘烤（尼龙膜）在2×SSC简单的洗涤一下膜将尼龙膜放在80℃下真空烘烤2小时固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：如果那么你想继续实验立即将这个膜进行预杂交如果你想稍后进行实验那么将完全干燥的膜用滤纸或者保鲜膜包裹后储存于2-8℃膜的储存：请根据下表选择膜的储存方法。二、探针标记和检测此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原（steroidhapten）去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。操作程序仪器设备试剂DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水pH8.0灭菌的EDTA标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE缓冲液洗涤缓冲液；马来酸缓冲液检测缓冲液；TE缓冲液DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备2×SSC或者20×SSC杂交尼龙膜，带正电荷杂交袋或杂交管，注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋*合适体积的容器用于杂交地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*，或者TE缓冲液洗涤缓冲液；马来酸缓冲液检测缓冲液；TE缓冲液DNA斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴10×SSC；10%SDS；NaOH附加仪器与所需试剂DIG-HighPrimelabeledprobescanbeusedinnorthern,Southern-,anddot-blotanalysis,aswellascolonyandplaquehybridizations.Thiskitoffersrandom-primedlabelingofDNAtemplateswithDIG-11-dUTP,alkali-labile,andchemiluminescentdetectionoftheDIG-labeledhybrids.Thiskitwasassembledwithconvenienceinmind,offeringready-to-useCSPDsuppliedwithadrippingdeviceforeasyapplication,ready-madeblockingsolution,andDIGEasyHybgranules.TheDIG-HighPrimemixtureincludesstabilizedKlenowenzyme,nucleotides,primers,andreactionbuffer,allinoneconvenientreagent.ApplicationSensitivityandspecificity:Standardassayuses1µgoflinearizedpBR328.Itisusualtoexpect0.8µglabeledDNAafter1hoflabeling,and2.3µglabeledDNAafter20hreaction.Inadotblothybridization,0.03pgofhomologousDNAisdetectablewithchemiluminescence(probeconcentrationsat20ng/ml).Asinglecopyhumangene(t-PA)isdetectableinaSouthernblot,loading1µgofdigestedplacentaDNA.ProductDescription1.DIG-HighPrime,5xconc.,50µl（用于探针标记）2.DIG-labeledControlDNA,20µl,(5µg/ml)pBR328(linearizedwithBamHI)（用于估测探针产量）3.DNADilutionBuffer,3x1ml（用于估测探针产量）4.Anti-digoxigenin-APConjugate,50µl（化学发光检测探针-靶序列杂交）5.CSPD,ready-to-use,50ml（化学发光检测探针-靶序列杂交）6.BlockingSolution,10xconc.,4x100ml（化学发光检测探针-靶序列杂交）7.DIGEasyHybGranules,4x100ml（用于探针与膜的杂交）KitContents用20×SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。步骤操作1向一个反应管仲中加入1μg模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μL。2沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。3充分混合DIG-HighPrime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心。孵育1小时或者过夜。注意：较长的孵育时间（最高达20小时）能够提高地高辛标记DNA的产量。4加入2μL0.2MEDTA（pH8.0）和/或65℃加热10分钟终止反应。注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp到1000bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长度。1、探针标记与标记效率的检测杂交工作溶液的制备分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。杂交温度适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下：Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/I){I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算}Topt.=Tm-（20～25℃）这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt.要比计算出的Tm低20-25℃。Topt.可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤温度）。步骤操作1将适量体积的杂交缓冲液（10ml/100cm2滤膜）提前预热到杂交温度（37-42℃）。将点样后的膜放入杂交缓冲液中在适当的容器中温和振荡30分钟进行预杂交。注意：膜应该自由的移动。尤其是如果你在同一个预杂交溶液中放入几张膜。2变性地高辛标记的DNA探针（在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL）：将新标记的探针放入沸水浴中煮5分钟后快速放入冰水混合物中冷却。注意：因为DIG-11-dUTP是碱标记的，因此DNA探针不能用碱处理（NaOH）的方法变性。3将变性的地高辛标记探针加入到预热的地高辛杂交缓冲液（每100cm2的膜加入3.5mL杂交缓冲液）中，充分混合但要避免产生泡沫（气泡容易产生背景）。4倒出预杂交液，向膜上加入探针杂交液的混合物。温和振荡孵育4小时或延长孵育至过夜。2、预杂交和杂交杂交液的储存：含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25℃，可以反复使用几次，在每次使用前需要68℃新鲜变性10分钟。注意：不可以将杂交液煮沸。3、洗膜步骤操作1用足够的2×SSC,0.1%SDS连续振荡洗涤两次，每次5分钟。15－20℃。（低严谨度，高盐低温）265℃，用足够的0.5×SSC,0.1%SDS（提前预热到洗涤温度）连续振荡洗涤两次，每次15分钟。（高