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第六章微生物生长及其控制主要内容：第一节测定微生物生长的方法第二节微生物的生长规律第三节影响微生物生长的主要因素第四节微生物培养第五节微生物生长的控制微生物生长的几个概念☞个体生长☞群体生长个体数量的增加或细胞群体总质量的增加。☞繁殖（reproduction)：微生物个体数目的增加。群体生长=个体生长+繁殖微生物个体细胞物质、结构组分和体积有规律地、不可逆地增加。第一节微生物生长的测量细胞数目（计繁殖数）的测定细胞物质(biomass，生长量)的测定第六章微生物生长及其控制一、细胞数目的测定显微镜直接计数法菌落计数法比浊法库尔特电子计数器计数法流动式细胞光度计第一节微生物生长的测量显微镜直接计数法每毫升原液所含菌体数（个）=每小方格平均菌体数×400×10×1000×稀释倍数不足：۞不能区分死细胞和活细胞，应用范围较窄۞一些小的细胞在显微镜下很难看到；۞样品中菌液浓度不能低于106个/mL۞不能用于菌丝体或呈链状而不分散的微生物测定。第一节微生物生长的测量菌落计数法（活菌计数法）★平板菌落计数法★载片培养计数法★微孔滤膜法第一节微生物生长的测量-细胞数量的测定平板菌落计数法灵敏度高可以区分死活细胞应用广۞优点۞不足测定的结果误差也较大。操作也比较烦琐需要的时间较长第一节微生物生长的测量第一节微生物生长的测量-细胞数量的测定比浊法原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光吸收值(OD)成正比，菌数越多，OD越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的OD，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。细胞数目或干重与培养液浊度的关系第一节微生物生长的测量-细胞数量的测定库尔特电子计数器计数法第一节微生物生长的测量-细胞数量的测定流动式细胞光度计快速细胞计数，其计数的效率可达3000个/秒分析分检第一节微生物生长的测量-细胞数量的测定二、细胞物质的测定۞重量法۞细胞沉降体积法۞细胞量的间接估计第一节微生物生长的测量重量法第一节微生物生长的测量-细胞物质的测定将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干至恒重(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。细胞量的间接估计测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度、ATP等，都可用于生长量的测定。第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长二、微生物的群体生长一、微生物的个体生长和同步生长个体生长——微生物个体细胞物质、结构组分和体积有规律地、不可逆地增加。个体生长研究方法：电子显微镜超薄切片同步培养技术（synchronousculture）：设法使群体中的所有细胞尽量都处于同样的细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。同步生长（synchronousgrowth）一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。获得同步生长的方法环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基、加入抑制剂-解除抑制等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。温度开始很低，使其均处在仅活着的状态——升高温度——同步生长抑制ＤＮＡ生长法：加入代谢抑制剂，阻遏DNA复制——解阻遏——同步机械法选择—收集同样大小的细胞密度梯度离心选择性滤膜法一、单细胞无分支微生物的典型生长曲线生长曲线的制作：将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测量活细胞数目。以培养时间为横坐标，以细胞增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。微生物的群体生长典型的生长曲线延滞期对数期稳定期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（growthraceconstant，每小时分裂次数）不同☆生长曲线代表了微生物在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。其它名称：停滞期、调整期、适应期现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。生长速率常数=0个体特点：细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）1.延滞期（lagphase）原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物分裂迟缓、代谢活跃菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期；培养基成分：◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；◇接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长影响延迟期长短的因素：认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短lagphase的措施有：①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数生长期的健壮菌种；③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。④选用繁殖快的菌种◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌(2)指数期（exponentialphage），又叫对数期（logarithmicphase）现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。细胞特点：酶系活跃，代谢旺盛；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；典型的细菌生长曲线代时和倍增时间代时：细胞繁殖一代所需要的时间。倍增时间（G）：细胞数目或细胞物质增加一倍所需要的时间。生长速率常数R:每小时分裂的次数LgX2=nlg2+lgx1n=————————=3.322(lgX2-lgX1)lgX2-lgX1lg2指数生长可以用下式表示：X2=x12n式中：x1为起始时细胞数目，x2为指数生长某个时刻t时的细胞数目，n为世代数例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（x1），经4h（t）后增加到49，000，000（x2），这样，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。生长速率常数R：★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。★代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1～3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。微生物生长的重要参数——代时影响微生物代时的因素菌种营养成分营养物浓度培养温度一些细菌的代时菌名培养基培养温度℃代时minE.coli（大肠杆菌）肉汤3717E.coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶3716~18E.aerogenes组合3729~44B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶3766~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌）牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖25344~46Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合37792~93Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌）组合271200不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli在不同温度下的代时温度（℃）代时（分）温度（℃）代时（分）10860352215120371720904017.525404520302947.577营养物质的浓度对生长速度的影响8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。认识对数期的特点对生产实际的指导意义3.稳定期（stationaryphase），又称：恒定期或最高生长期（1）特点：新生的细胞数目与死亡的细胞数目相等，总菌数达到最大值，活菌数保持恒定。细胞转向衰老，生长不平衡。代谢产物逐渐积累。典型的细菌生长曲线（2）出现的原因：▶营养物尤其是生长限制因子的耗尽▶营养物的比例失调，如碳氮比不合适;▶有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）▶物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;00.20.40.60.80816242832364044485256647205001000ODPhenol(mg/l)Time(h)指导意义发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：•补充营养物质（补料）•调pH•调整温度指导收获：生产氨基酸、核苷酸或收获菌体时可在稳定期收获。4.死亡期（declinephase），又叫衰亡期（1）特点：细胞的死亡率将逐渐增加，群体中活的细胞数目急剧下降；细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。细胞裂解或自溶，释放出一些代谢产物。典型的细菌生长曲线（2）产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡4、二次生长二、丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。可分为三个阶段：1、生长停滞期2、迅速生长期3、衰退期1、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。二、丝状微生物的群体生长三、连续培养（continuousculture）分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。三、连续培养（Continuousculture）最