常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程

******GMP文件第1页共8页目的：规范液相色谱柱的使用与管理；液相色谱柱标准化老化与再生；剖析液相色谱柱常见问题与解决办法。延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本。提高分析人员液相色谱柱使用与维护水平。范围：适用于使用高效液相色谱仪的仪器分析操作人员及相关管理人员。责任：设备员、液相操作人员、质控主管、质量管理部经理、质量受权人。内容：1.定义1.1液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。1.2色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。1.3运载溶剂：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。1.4保存条件：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存条件。1.5保存溶剂：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与比例的溶液。1.6反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。1.7正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱，常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。1.8氨基柱（-NH2）：可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。[氨基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，例如：正己烷-乙腈（99：1）]。2.液相色谱柱的使用及保养文件题目常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程文件编号及版本号SOP-QC-000-00起草人起草日期年月日复制份数2份审核人审核日期年月日颁发部门质量管理部批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门质量管理部、质控室编订依据实用中药药品检验检测技术指南******GMP文件第2页共8页2.1普通C8及C8反相色谱柱的老化处理与使用保养程序新购色谱柱出厂前均采用适合的运载溶剂饱和，密封，由于运输过程周期较长，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新饱和与老化。若老化方法不正确或时间不够，极易导致色谱柱在使用较短时间后即产生分离度下降、峰形变差、峰拖尾等柱效降低的情况。需根据色谱柱不同类型选择不同饱和与老化方法。2.1.1老化2.1.1.1老化前准备：准备新鲜的超纯水及色谱级乙腈或甲醇，冲洗色谱仪器系统，保证仪器系统管路干净。2.1.1.2将色谱柱反向连接，不接检测器。用水-有机相（90：10～95:5），以0.3ml/min～0.6ml/min流速冲洗20min～30min（目的是冲洗出柱入口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）。2.1.1.3再将色谱柱正向连接，不接检测器。用水-有机相（90：10～95:5），以0.3ml/min～0.6ml/min流速冲洗20min～30min（目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）。2.1.1.4连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～95:5），以0.3ml/min～0.6ml/min流速冲洗4h以上（目的是充饱和色谱柱，去除柱内空气）。2.1.1.5老化色谱柱：用水-有机相（10：90～5:95），以0.3ml/min～0.6ml/min流速冲洗2h以上[或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3ml/min～0.6ml/min流速冲洗]；再用100%有机溶剂，以0.3ml/min～0.6ml/min流速冲洗1h以上；最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上（不同品牌色谱柱需区别对待）。2.1.2使用2.1.2.1相平衡过渡:根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30min左右；如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡，必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。2.1.2.2然后更换成新制并经0.45μm滤膜过滤，超声脱气后的流动相，按检测方法平衡至少1h，待基线稳定后，开始进样检测。2.1.3维护与保养2.1.3.1新柱首次使用，在进样完成后需立即对色谱柱进行净化和有机溶剂饱和。方法是：用水-有机相（90：10～95:5），以0.6ml/min流速冲洗1h以上；再用水-有机相（90：10～95:5），以1ml/min流速冲洗30min以上。（或者采用溶剂梯度变化至100%有机相冲洗120min以上）；最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上；若流动相中有缓冲盐，建议用100%水冲洗1h以上后，再重复上述净化程序（但个别品牌C8或C18色谱柱不耐受纯水冲洗者例外）。2.1.3.2新色谱柱使用几次，均正常后，运行完毕净化处理程序可简化为：用水-有机相（90：文件题目常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程文件编号及版本号SOP-QC-000-00******GMP文件第3页共8页10～95:5），以1ml/min流速冲洗1h以上；再用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗30min以上。当供试品溶液中含有一定量表面活性剂，多次进样后，由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜，导致峰变宽、拖尾甚至分叉。此时，处理方法如下：将色谱柱反向连接，不接检测器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速冲洗2h以上；再用100%乙腈，以0.6ml/min流速冲洗1h以上，然后正向连接好色谱柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速冲洗1h以上；再用100%乙腈，以1ml/min流速冲洗1h以上，即可恢复。2.1.3.3净化完毕，若次日不再使用，选择柱说明书中保存条件规定的保存溶剂冲洗10倍柱体积以上，可取下色谱柱，用封头螺丝密封，交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下，备案。2.1.3.4若色谱柱使用后入库保存，长时间未使用，重新使用时仍需重新饱和。方法是：用水-有机相（90：10～95:5），以0.6ml/min流速冲洗1h以上；再用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗30min以上；然后调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30min左右；最后用流动相平衡1h以上，进样检测。必需注意流动相pH值不能超过色谱柱pH耐受范围，过酸容易使键合相变态，过碱则易导致硅胶溶解柱床塌陷。2.1.4常见故障处理与色谱柱再生2.1.4.1当色谱柱使用较长时间之后，就可能发生柱压升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等情况，这时就需要根据故障原因对色谱柱进行清堵与再生，以延长色谱柱的使用寿命。具体原因及处理方法如下：2.1.4.2筛板堵塞与柱头塌陷：主要现象有柱压严重升高或不稳定、色谱峰拖尾、色谱峰变宽、色谱峰分叉、秃峰等，需要进行清堵与弹性复原处理。（此方法适合于任何类型有相同故障的色谱柱的处理，不同的是溶剂要与相应类型色谱柱匹配。）主要处理方法如下：2.1.4.2.1一般情况下，将色谱柱反接，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约4h；再正向连接，接或不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速冲洗约1h；再提高流速至1.0ml/min冲洗1h，观察柱压变化。若不凑效，则拧开柱头螺母（色谱柱进口），小心取下筛板，用5%左右的硝酸溶液超声处理20min左右，再用纯水超声20min左右。用小勺清理掉柱进口污染的部分填料，再将用乙醇调和后的相应的硅胶装入柱入口（也可用已经报废的同类柱中的填料替代），用平面不锈钢小铲压紧填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否则，压得太紧柱压会升高，然后装上清洗过的筛板，注意筛板安装方向必需与原装相同，最后紧固。2.1.4.2.2冲洗与饱和：清堵紧固后，先反向连接色谱柱，不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约4h；再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约2h；再正向连接色谱柱，接或不接检测器，用纯水或水-有机相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速冲洗约2h；再换成甲醇以0.5ml/min流速冲洗约1h；然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速冲洗约文件题目常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程文件编号及版本号SOP-QC-000-00******GMP文件第4页共8页1h以上，再根据测试用流动相比例调整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速冲洗约1h；最后用测试用流动相平衡2h，进样测试即可。2.1.4.2.3特殊说明：如不是特殊情况，按其他办法可行，则最好不要反冲色谱柱和拆卸筛板。2.1.4.3柱效降低：主要特征性现象有柱压基本正常，但出现拖尾峰、秃峰、分叉峰、前延峰、峰变宽、基线漂移、理论板数降低、分离度降低等。需要进行再生处理，具体方法如下：2.1.4.3.1一般情况下，顺接色谱柱，按如下溶剂顺序及条件冲洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）；100％甲醇（1.0ml/min，1h以上）；100％乙晴（1.0ml/min，1h以上）；75％乙晴-25％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）；100％异丙醇（0.5ml/min，10倍柱体积以上）；100％二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上）；100％正己烷（0.5ml/min，10倍柱体积以上，根据实际情况可忽略）；100%异丙醇（0.5ml/min，20倍柱体积以上）；95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱体积以上）；检测用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试。在冲洗过程中，随时关注柱压变化，确保不超过4000psi；若超出，可通过降低流速，升高柱温来调整。2.1.4.3.2若上述方法效果不理想，可按如上溶剂顺序和条件，先反接色谱柱冲洗；再顺接色谱柱，用100%乙腈以1ml/min流速冲洗约2h；再用与流动相同比例的水-有机相以1ml/min流速冲洗约30min；最后用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试即可。2.1.4.3.3特别说明：再生过程必须随时关注柱压变化，柱压过高易导致硅胶变形与开裂及键合相极性端连接顺序紊乱，同时要保证再生时间足够。2.1.4.4当分析复杂样品时间过长，尤其是中药分析，若出现柱压正常而色谱峰形变差，分离度降低时可尝试如下方法再生2.1.4.4.1先用5%甲醇（或乙腈）-95%水，将色谱柱反向连接，以1ml/min冲洗60min以上；再用四氢呋喃（或丙酮）以0.5ml/min冲洗60min以上（去除脂类）；再用65%甲醇（或乙腈）-35%水，以流速1ml/min冲洗60min；然后用纯甲醇或乙腈冲洗30min；接着用与流动相同比例的水；有机相以1ml/min流速冲洗约30min；最后用流动相平衡2h，进样测试即可。2.1.4.4.2特别提醒：再生时最好选择不具备在线脱气的独立泵送系统色谱仪器进行，以防正相溶剂损坏脱气机密封膜或分子筛及比例阀等仪器精密部件。2.1.4.4.3警告：无论何时，必须保证色谱柱柱床不干涸，尤其是进样检测和柱冲洗过程中不能让流动相长时间（30min以上）走空，否则易使色谱柱干涸且带入大量几乎无法排出的气泡，甚至导致柱床局部塌陷或中部开裂。使用与保存时，严禁用力甩，绝对杜绝不小心猛烈撞击或高处掉落，否则，易导致柱床机械性损坏，则再无再生可能。2.2正相色谱柱的老化处理与使用保养程序2.2.1新购氨基柱老化处理及使用基本程序如下：文件题目常用液相