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实验室落菌种类摘要：归纳了组织培养中污染原因及不同污染原因所造成的表观现象,并概括了解决外植体引发污染的方法。发现棒杆菌属(Corynebac2terium)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡萄球菌属(Staphylococus)、地霉属(Geotrichum)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)等常见的细菌和真菌是引起组培苗严重污染的主要菌类。取样测试鉴定表明,大部分的微生物来源于无菌接种室内的空气、超净工作台鼓风机排出的气体。研究了壳聚糖对该菌的抑制作用，探索了3种分子量及其6种浓度的壳聚糖对该菌的抑制效果。壳聚糖对该污染菌有抑制作用，5万和25万分子量的抑菌效果高于3000分子量，浓度越高，抑菌效果越好。初步证实了壳聚糖对组培污染菌类有很好的抑制作用，在花卉组织培养污染防治方面具有应用价值。关键词植物组织培养;污染;外植体;灭菌组织培养；污染；壳聚糖；抑制作用从德国植物生理学家Haberlandt1902年提出设想到现在,植物组织培养的研究已有100多年的历史,近几十年来植物组织培养技术发展最为迅速。然而植物组织培养一些技术环节仍然存在不少问题,其中污染、褐化、玻璃化被认为是组织培养的三大杀手。与褐化、玻璃化相比污染更易发生,给科研和生产实践带来巨大的危害。因此采取有效的防控措施,降低污染发生的机率,是组织培养成功的重要保障。在众多污染途径中,外植体携带微生物污染组织培养是最常见且不易解决的问题。笔者通过对相关文献的分析,并结合实践,归纳了组织培养过程中引起污染的原因及各种污染的表观现象,提出解决外植体引发污染的措施。1污染的原因及其表观现象污染就是在组织培养过程中微生物进入培养体系,在外植体上、外植体周围的培养基以及培养基的其他部位生长。由于植物组织培养过程中的温度、湿度、营养、pH值等适宜微生物的生长,因此一旦微生物进入培养容器中就将快速繁殖,通过营养竞争、侵蚀植物材料、分泌有毒代谢产物等途径使植物材料发生病害或死亡,造成组织培养的失败。造成污染最常见的微生物是细菌和霉菌,有时也可以是酵母菌。主要细菌有:棒杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobac2ter)、葡萄球菌(Staphylococus);主要霉菌有:地霉属(Geotrichum)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)等(周俊辉等,2002)。造成污染的原因很多,从时间角度可以将污染发生原因归纳为3个阶段:①前期准备阶段。包括培养基灭菌不彻底、器皿的灭菌不完全,外植体的选择不当与消毒不彻底;②无菌操作阶段。包括无菌操作室灭菌和超净工作台有问题,操作不规范,操作工具的消毒不彻底等;③培养阶段。培养环境不清洁和培养体系意外开放等。组织培养中,是否污染通常通过观察培养过程中培养基是否出现菌落来判断。不同成因造成的污染表观现象大多存在差异。通过对同批培养材料的菌落位置、菌落数、出现时间的观察,即可初步判断出污染的原因。例如,对于培养阶段中的污染,虽然发生时间不确定,但是组织培养周期一般在30d左右,因此在前2～3d污染发生的概率比此后的概率低得多,一般在培养较长时间后才观察到菌落的出现;而超净工作台或操作人员导致的污染则在培养几天后即可观察到,因此可以根据不同的污染表观现象寻找到污染的成因(表1)。需要说明的是表1中的判断标准并不是绝对的。例如,1个外植体带入的污染可能不只是1个菌体而是多个菌体,会形成多个菌落,但最后菌落相连,表现为1个菌苔;有时污染是几个原因叠加的结果,所以表观现象会比表中所列出的现象复杂得多。2外植体消毒2.1选择好外植体外植体也就是组织培养的材料。外植体表面和内部常携带一些微生物,是组织培养过程的主要污体表面和内部常携带一些微生物,是组织培养过程的主要污染源,外植体污染也是组织培养中众多污染途径中最难解决的一个。为了减少外植体导致的污染,应该选取合适的材料,尽可能选取带菌少以及不携带内生菌的外植体。①选取胚和无病害的茎尖等,减少携带内生菌的机率;②不同季节外植的带菌情况不同,选择适合的季节采集外植体,可以减少污染;③将有土栽培改为无土栽培,减少植物携带微生物的机率;④将室外的植株在移栽入清洁的室内,生长一段时间后,再取外植体。2.2选择合适的消毒方法对于大多数外植体只需要进行表面消毒即可,而有些外植体由于具有内生菌,为达到较好的灭菌效果除需要进行表面消毒外还需要其他处理。2.2.1对外植体表面灭菌。外植体表面灭菌的关键是选择合适的消毒剂和消毒时间。因为消毒剂不仅杀灭微生物,也对外植体产生一定的伤害。例如氯化汞的杀菌能力最强,最为常用,但它对外植体的伤害也最大,不易去除。不同植物或同一植物不同外植体消毒的方法是不同的,为达到满意的灭菌效果,需要根据外植体的情况,选择合适的消毒剂,摸索出合理的消毒时间(表2)。消毒剂的种类和消毒时间的长短并不局限于表2所列,如焦立为等(2002)用臭氧对橡皮树带有顶芽的叶片进行消毒,结果表明,臭氧用于外植体消毒灭菌的效果很好,接种20d后,污染率为0%,且顶芽(有鳞叶包被)接种后的成活率极高;AbdulQayyumRao等(2006)采用0.1%HgCl2对棉花种子表面消毒时,采用较长的灭菌时间,种子在消毒液中浸泡20min,超出表2中的时间范围,但不会对种子造成伤害。外植体的表面灭菌中,常用的消毒剂使用方法有:①单一消毒剂灭菌。即只用1种消毒剂对外植体进行消毒;②联合消毒剂灭菌。使用1消毒剂对外植体消毒一段时间后,再将外植体转入另一种消毒剂中进行消毒,最常见的联合消毒剂灭菌是使用酒精—升汞和酒精—次氯酸钠;③混合消毒剂灭菌。就是将2种或几种消毒液混合后,对外植体进行消毒;④联合与混合并用。刘香玲等(2005)在进行水稻组织时,使用混合消毒剂对水稻种子进行灭菌,将水稻种子去壳后,先用70%酒精消毒1min,再用0.1%升汞和2%NaClO(1∶1)的混合消毒液浸泡20min。2.2.2对携带内生菌的外植体消毒。对于容易携带内生菌的外植体消毒要比表面消毒复杂得多。主要方法:①在外植体表面消毒前,采用超声波、热击等物理方法处理后再进行表面消毒。例如,G.M.G.M.Hol等(1992)以水仙的鳞茎为外植体进行组培时发现,采用1%的次氯酸钠对其进行灭菌时,当灭菌时间为30min时,污染率为40%～60%;将灭菌时间延长为2h甚至4h后,仍然不能降低污染率;而在使用消毒剂前用热水浸泡,可以将污染率降低到5%。②在消毒液中添加表面吸附剂吐温20。任敬民等(2004)在对台湾青枣组织培养的消毒方法的研究中发现,在0.1%升汞中加入3～5滴吐温20的消毒效果要优于不添加吐温20的消毒效果。③在培养基中添加抗生素来防止污染。郑永强等(2003)在生姜组织培养研究中发现,在初代培养时采用剥离至茎尖仅剩3～4叶原基进行表面消毒后,接种于含25～50mg/L的硫酸链霉素和硫酸卡那霉素混合液防止污染效果较好,在继代培养过程中培养基中抗生素浓度达25～50mg/L,污染的培养基基本表现无菌状态。在使用抗生素时要有针对性地选择抗生素的种类和使用浓度,一种抗生素可能只对1种或几种微生物有效;浓度低了效果差而浓度高又容易对植物产生毒害(周俊辉等,2003)。对于污染严重的并且尚不能摸索出有效灭菌方法的外植体,在组织培养中,尽可能减少单位培养容器中外植体的个数,每个培养容器中可以只接入一个外植体,这样可以获得相对大的无污染率3结束语组织培养中污染的发生是极其普遍的。如何有效的防治污染,成为组培工作的重点。笔者通过实践发现,大多数由不同成因造成的污染,其表观现象是有区别的,将污染后的表观现象与造成污染的原因对应起来,有利于快速找到导致污染的原因,然后采取针对性措施加以防治,就可以减少逐个环节排查的大量工作。特别是在一些组织培养生产中,培养程序化,一旦发生重复性污染,往往是某个固定环节的失误造成的,通过观察污染的表观现象,可以快速寻找到导致污染的原因,这样可以大大节省人力和成本。污染几率。在植物组织培养工作中,对培养基和器皿的彻底灭菌及正确的无菌操作是防止染菌、保证组培材料正常生长及分化的关键,是组培工作中最基本,也是最重要的技术。从事与组培工有关的科学工作者,在实践中应能根据工作的性质、条件及要求,灵活、巧妙地应用有关的原理,熟练、敏捷、正确地进行操作。灭菌、消毒和除菌所谓灭菌系指采用物理或化学的方法杀死物体表面及内部的全部微生物。它有别于消毒。消毒一说来源于医学,是一种卫生措施,通常指只杀死有害的病原微生物。除菌是应用机械或其他物理的方法除去液体或气体中的微生物,达到无菌净化之目的。可见灭菌及除菌后的物体或介质是无菌的,而消毒后的物体可能仍含有许多微生物。在教学和工作中常常听到把灭菌称为消毒,将除菌说成灭菌,或将灭菌、消毒和除菌三个不同的概念混为一谈。这是应该予以澄清的。高温灭菌高温灭菌是指用热能杀死微生物。其原理是高温使原生质中的蛋白质变性、使酶失活,致使微生物死亡。高温灭菌是植物组培中最常用的灭菌方法,主要的有高温蒸气灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌。高温蒸气灭菌蒸气灭菌属湿热灭菌。由于湿热灭菌有潜热存在,被灭菌物体的温度比蒸气的低,蒸气在其表面凝结成水,放出潜热,可迅速提高被灭菌物体的温度。又由于水和水蒸气比空气的热容量大、导热快、穿透力强,所以,与干热灭菌比,需要的温度低、时间短,组培中常用于培养基和器皿的灭菌。水蒸气的温度随其所受压力的增加而升高,因而灭菌用的高温蒸气都是通过加压获得的。手提式高压灭菌锅是组培工作中最常用的高压灭菌装置。操作中常见的错误有排气不彻底。在升压前应将锅内冷空气排净,因空气是热不良导体,若不排净,冷空气就会聚集并滞留在灭菌锅中消毒筒的中下部,围绕在待灭菌物周围。在这种情况下,假若锅内空气仅排除一半,当压力表指针达到时,锅内实际温度仅能达到℃,比要求的’低之多,将导致灭菌不彻底,可能造成大面积染菌。排气软管没按要求插入灭菌筒内的下部,或排气软管断裂、缺失。灭菌锅内的冷空气是通过排气软管排出的,上述情况将造成灭菌筒外的蒸气直接经排气阀排出锅外,灭菌筒内的空气排放受阻。消毒筒内物品堆积太紧、太满,阻碍蒸气的流通和热交换,使容器内升温减慢,造成物体内部杀菌不完全。升温过快。灭菌的时间是以达到要求温度后的持续时间计算的,但温度的升降过程同样起到杀菌的作用,升降温过快会通过影响总的积温而影响灭菌效果。另外,升温过快,特别是使用外源蒸气的情况下,会造成被灭菌物体内部升温滞后于压力表指示温度。灭菌的物体休积容量过大。组培中,高温蒸气灭菌通常要在、即蒸气压力为,,或三·磅时,或下保温。这一规定仅适用于试管、三角瓶中小容量的培养基小于。若体积过大,特别是固体培养基,会造成灭菌不彻底,应适当延长灭菌时间。任意延长灭菌时间。规定的灭菌温度和时间是经过科学试验制定的,只要按照正确的灭菌程序操作是能达到灭菌目的的。但在实践中常有人为了“保证彻底灭菌”而任意延长灭菌时间。这样操作忽视了杀菌过程中温度对培养基成分的破坏作用,是得不偿失的。温度不稳定。灭菌过程中温度压力忽高忽低,特别是手提式电能灭菌锅,它没有控温装置,难于控温。操作者可配置调压变压器,通过调节电压控温。此外,还常遇到灭菌锅内加水太少应加一,容器内装的溶液量过多应小于,安全阀失灵等问题。千热灭菌指在烤箱内用干热空气灭菌,常用于玻璃器皿和金属用具的灭菌。由于空气的导热性和穿透力小于饱和蒸气,加上菌体在受热脱水情况下又较耐热,因而,通常要在一‘下连续灭菌才能达到灭菌目的。曾遇见的错误操作有将灭菌物品如培养皿堆挥放置,且堆得过满、过挤,阻碍空气流通和热量的传递、交换升温时不打开箱顶通风孔,影响箱内冷空气及水气喷出造成烧伤及突然降温,使玻璃器皿破裂温度过高大干造成包装纸、棉塞焦化,失去防菌或过滤作用将不耐热的枪头、离心管、试管帽、滤器等塑料制品放入烤箱内灭菌,而致其熔化。灼烧灭菌即直接利用火焰将微生物灼烧致死。其特点是简便、迅速、彻底。主