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光学显微镜的构造和使用方法[实验目的]1.熟悉光学显微镜各部分的结构和用途，掌握显微镜维护的基本知识。2.初步掌握低倍镜、高倍镜和油镜的使用方法。[实验用品]1.材料：羊毛装片、血涂片、字母装片、兔脊神经节切片。2.器材：显微镜、擦镜纸、载玻片、香柏油、二甲苯。[实验内容与方法]一、显微镜的构造显微镜是一种复杂的光学仪器。它是医学实验常用工具之一，其作用是将观察的标本放大，以便观察和分析。一般光学显微镜包括机械装置和光学系统两大部分，如图1-1所示。（一）机械装置1.镜座：位于最底部的构造，为整个显微镜的基座，用以支持着整个镜体，起稳固作用。2.镜柱：为垂直于镜座上的短柱，用以支持镜臂。3.镜臂：为支持镜筒和镜台的呈弓形结构的部分，是取用显微镜时握拿的部分。镜筒直立式光镜在镜臂与其下方的镜柱之间有一倾斜关节，可使镜筒向后倾斜一定角度以方便观察，但使用时倾斜角度不应超过45°，否则显微镜由于重心偏移容易翻ss倒。4.调节器：也称调焦螺旋，为调节焦距的装置，位于镜臂的上端（镜筒直立式光镜）或下端（镜筒倾斜式光镜），分粗调节器(大螺旋）和细调节器（小螺旋）两种。粗调节器可使镜筒或镜台作较快或较大幅度的升降，能迅速调节好焦距,适于低倍镜观察时调焦。细调节器可使镜筒或镜台缓慢或较小幅度地升降，使用于在低倍镜下用粗调节器找到物体后，在高倍镜和油镜下进行焦距的精细调节，藉以对物体不同层次、深度的结构做细致地观察。5.镜筒：位于镜臂的前方，它是一个齿状脊板与调节器相接的圆筒状结构，上端装载目镜，下端连接物镜转换器。根据镜筒的数目,光镜可分为单筒式和双筒式。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种,镜筒直立式光镜的目镜与物镜的光轴在同一直线上,而镜筒倾斜式光镜的目镜与物镜的中心线互成45°角,在镜筒中装有使光线转折45°的棱镜；双筒式光镜的镜筒均为倾斜式的。6.物镜转换器：又称旋转盘，位于镜筒下端的一个可旋转的凹形圆盘上，一般装有2～4个放大倍数不同的接物镜。旋转它就可以转换接物镜。旋转盘边缘有一定卡，当旋至物镜和镜筒成直线时，就发出“咔”的响声，这时方可观察玻片标本。7.镜台：也称载物台,是位于镜臂下面的平台，用以承放玻片标本。载物台中央有一圆形的通光孔，光线可以通过它由下向上反射。8.标本推进器：位于镜台的后方或侧面边缘，连一可动弧形弹簧夹。其上方或下方一侧有两个旋钮，转动旋钮可调节推进器，使玻片标本前后或左右移动。标本推进器上有纵横游标尺，用以测定标本在视野中的方位及其大小。游标尺一般由主标尺(a)和副标尺(b)组成。副标尺的分度为主标尺的9/10。使用时，首先看副标尺的0点位置。然后看主、副标尺的一致点。如图i-2所示，副标尺的0点主标尺的26与27之间，副标尺的6与主标尺的32一致，即6与主标尺上的一个分度线正对，则此标尺所表示的数值为26.6mm。图1-2游标尺的用法(二)光学系统1.反光镜：是装在镜台下面、镜柱前方的一面可转动的圆镜，它有平凹两面。平面镜聚光力弱，适合光线较强时使用。凹面镜聚光力强，适于光线较弱时使用。转动反光镜，可将光源反射到聚光镜上，再经镜台中央圆孔照明标本。2.聚光镜：在镜台下方，是一组透镜，用以聚集光线增强视野的亮度。镜台上方有一调节旋钮，转动它可升降聚光镜。往上升时增强反射光，下降时减弱反射光。3.可变光栏：是在聚光镜底部的一个圆环状结构。它装有多片半月形的薄金属片，叠合在中央成圆孔形。在圆环外缘有一突起的小柄，拨动它可使金属片分开或合拢，用以控制光线的强弱，使物像变得更清晰。4.目镜：装在镜筒上端，其上一般刻有放大倍数(如5×，10×)。目镜内常装有一指示针，用以指示要观察的某一部分。图1-1显微镜的结构1.目镜2.镜筒3.物镜转换器4.物镜5.通光孔6.聚光器7.光圈8.反光镜9.粗调节器10.细调节器11.镜臂12.推进器13.载物台14.倾斜关节15.镜柱16.镜座17.照明装置18.粗调限位环凸柄标本推进器上有纵横游标尺，用以测定标本在视野中的方位及其大小。游标尺一般由主标尺(a)和副标尺(b)组成。副标尺的分度为主标尺的9/10。使用时，首先看副标尺的0点位置。然后看主、副标尺的一致点。如图i-2所示，副标尺的0点主标尺的26与27之间，副标尺的6与主标尺的32一致，即6与主标尺上的一个分度线正对，则此标尺所表示的数值为26.6mm。5.物镜：装在物镜转换器上，一般分低倍镜、高倍镜和油镜三种。低倍镜镜体较短，放大倍数小；高倍镜镜体较长，放大倍数较大；油镜镜体最长，放大倍数最大（在镜体上刻有数字，低倍镜一般有4×、10×，高倍镜一般有40×、45×，油镜一般是90×、100×，×表示放大倍数）。显微镜放大倍数的计算：目镜放大倍数×物镜放大倍数=显微镜对实物的放大倍数。二、显微镜的使用方法(一)低倍镜的使用1.把显微镜放在桌面的左侧，镜臂对向胸前，坐下进行操作。用手转动粗调螺旋，使镜筒上升，然后转动物镜转换器，使低倍镜对准镜台中央圆孔（当转动到听见“咔”声响，或同时亦感到有阻力时立即停止转动，说明物镜已与镜筒成一直线）。2.对光：拨动聚光镜底部圆环的小柄，使光栏完全打开。旋转聚光镜升降螺旋，使聚光镜上升到和镜台相平。用左眼（两个眼睛都要睁开）在目镜上观察，同时用手调整反光镜，对好光源。要求视野达到完全均匀明亮。3.放置玻片标本：取蛙血玻片标本放在镜台上，有盖玻片的一面朝上。玻片两端用移动器夹住，然后转动螺旋，使玻片上要观察的标本对准镜中央圆孔。注意，镜台上的刻度可以标示玻片的坐标位置。4.调节物距：转动粗调螺旋，使低倍镜距玻片标本0.5mm左右。注意：必须从显微镜侧面观察物镜与玻片的距离。切勿用眼在目镜上观察的同时转动粗调螺旋，以防镜头碰撞玻片造成损坏。用左眼从目镜上观察，用手慢慢转动粗调螺旋下降镜台，当视野中出现物像时，再调节细调螺旋，直至视野中出现清晰的物像（许多椭圆形的红细胞）为止。如果物像不在视野中央，可稍微移动玻片位置（注意：移动玻片的方向与观察物像移动的方向恰好是相反的）。反复练习上述各操作步骤，做到迅速熟练地找到标本，以及取光合适（即较熟练的应用反光镜、光栏和聚光镜）。(二)高倍镜的使用1.一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，并把要放大的部分移至视野正中，同时调节到最清晰程度，才能进行高倍镜的观察。2.转动物镜转换器，使高倍镜转到镜台中央圆孔处。转换高倍镜时速度要慢，要细心，并从侧面进行观察（防止高倍镜碰撞玻片）。如果高倍镜碰到玻片，说明低倍镜的物距没有调节好，应重新进行操作。3.调节物距：转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察。这时物像往往不清楚、或者要观察的部分不在视野当中，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动（切勿用粗调螺旋）即能清楚看到物像。一般只需转动半圈或一圈就能达到要求。在高倍镜下，可见蛙血红细胞呈椭圆形，外被细胞膜，膜内为浅红色细胞质，中央有一圆形呈蓝紫色的细胞核。(三)油镜的使用1.首先在高倍镜下找到所要观察的标本后，把所要观察的部分移至视野中央。2.转动物镜转换器，移开高倍镜，在标本上所要观察的位置加一滴镜油（香柏油）。3.转动物镜转换器，转换油镜，使之对准镜台中央圆孔处，浸在油滴中。4.转换好油镜后，用左眼在目镜上观察。物像如不清楚，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动，即能清楚地看到物像。如仍看不清标本，需重新用低倍镜、高倍镜观察，然后再转换油镜。5.观察完标本后，用滴加上二甲苯的擦镜纸擦拭干净油镜镜头，再用另一张清洁的擦镜纸盖在玻片标本上，滴上1～2滴二甲苯，轻拉擦镜纸，将玻片上的镜油擦去。注意，勿擦坏标本。三、使用显微镜注意事项1.持镜时要一手紧握镜臂，一手托住镜座，绝不能一把提起显微镜便走，以防目镜从镜筒滑出或反光镜脱落。2.轻拿轻放，不要把显微镜放在实验台边缘，防止碰翻落地。3.显微镜光学系统部件要用清洁的擦镜纸轻轻揩擦，切勿口吹、手抹或用粗布揩擦。4.使用时先用低倍镜调整光线。观察活体标本或染色较浅的标本时，要适当关小可变光栏便视野变暗，方能看得清楚。5.放置玻片标本时要对准镜台孔正中央，并且不能反放玻片，如标本玻片反放时高倍镜下看不到物像，并容易压坏玻片或物镜。6.观察时要双目睁开，切勿闭上一只眼睛。左眼观察视野，右眼用以绘图。低倍镜用粗调螺旋调节物距，高倍镜要用细调螺旋，粗、细调节螺旋都不能单方向过度地旋转。单向上升粗调螺旋会压碎镜片和损坏物镜。7.不要随便取出目镜，以防尘土落人物镜上。也不要任意拆卸任何零件，以防损坏。8.使用完毕后，转动粗调螺旋使镜台下降，取下玻片，转动物镜转换器，使物镜离开聚光孔。再上升镜台使物镜接近镜台（不要对着镜台孔）。然后以右手握镜臂，左手托镜座轻轻放人镜箱中。9.每次使用显微镜之前，先按显微镜登记卡片逐项检查显微镜各部分有无损坏。如发现损坏，应及时向教师报告。使用之后，认真填写显微镜使用登记卡片。四、操作练习（一）低倍镜、高倍镜的使用练习1.观察文字或字母装片：取一片字母装片，用低倍镜观察，反复练习对光、调光、标本放置和调节焦距等。如将玻片前后左右移动时，注意物像与玻片移动方向是否一致，玻片上的字母是正像还是反像，为什么?2.观察羊毛片（或头发）交叉装片：取一张毛（发）交叉装片，先用低倍镜观察，找到两根毛（发）后，再将毛（发）交叉点移到视野中央，然后换高倍镜观察，再轻微转动细调节器，观察不同层次，判定哪条毛（发）在上方，哪条位于下方。（二）油镜的使用练习1.取一张血涂片或取血一小滴，滴于清洁的载玻片一端，另取一张边缘平整的载玻片，按照图1-3所示做成血涂片。先用低倍镜再用高倍镜进行观察。图1-4蛙血涂片图1-5运动神经细胞2.用油镜观察，并分辨红细胞、白细胞和淋巴细胞，比较三种物镜的放大倍数和分辨率。3.观察兔脊神经节切片（示固定染色的细胞）取兔脊神经节切片标本先在调好光线的低倍镜下观察（固定染色的标本需调较亮光线），低倍镜下找到要观察的标本，为淡紫色的神经节切面，在其外围包有被膜，且向内伸入，形成神经节的结缔组织支架，节内有许多大小不等的神经细胞，呈散在分布。然后转换高倍镜，选择完整而清晰的圆形图1-6感觉神经细胞神经细胞仔细观察其内部结构。可见到在细胞中央有一圆形核，核内有着色为深紫红色的圆形核仁及染色质颗粒，核与细胞膜之间是均匀浅紫色的细胞质，在细胞的外面围有若干个被囊细胞，它起保护神经细胞的作用。在神经细胞之间还可看到有轴索横断面和许多神经纤维，多呈交错排列。s图1-3血涂片的制备方法4.观察完毕，务必将油镜按正确方法擦净。五、其它几种显微镜简介目前在生物学和医学研究中，常用的显微镜，还有以下几种：1.双筒解剖显微镜：解剖较小标本或观察玻片标本的全貌时，需使用解剖显微镜，以观察自然状态下较小的实体（正像）和较大的玻片标本，或解剖细小生物。2.暗视野显微镜：是一种具有暗视集中器或中央遮光板的显微镜。即在聚光镜上加一特殊装置，使光线从集光器透镜的边缘衍射或反射到标本上，经标本反射投入物镜内，使整个视野变暗，故能在视野中见到被检物体衍射之图像。这种显微镜可观察运动着的有机体。3.荧光显微镜：其特点是以紫外光为光源，利用紫外光照射，使标本内的荧光物质激发出不同颜色的荧光，以研究标本内某些物质的特征和位置。有些物质本身能发出荧光，有些物质需经荧光染料染色后才能发出荧光。4.相差显微镜：活细胞在普通光镜下，一般不能分辨其细微结构。这是由于各细微结构的折光性很近似或对比不够显著的缘故。相差显微镜则是在聚光器下装一个环状光栏，其物镜是安有相板的相差物镜。环状光栏的作用是造成空心的光线锥，使直射光和衍射光分离。相板的作用是使直射光和衍射光发生干涉，导致相位差变成振幅差(即明暗差)，使反差加强。所以，可以观察活细胞中不同染色的微细结构。5.倒置显微镜：物镜位于标本的下方，而光源位于标本的上方。主要用于细胞培养时观察培养瓶中细胞的生长情况。[实验报告与思考题]绘图1.绘制兔脊神经节细胞(高倍视野)。2.绘制蛙血细胞(油镜视野)。思考题1.怎样区分低倍镜、高倍镜和油镜，为什么用高倍镜或油镜时，必须从低倍镜开始?2.如果在高倍镜下末找