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第二十二章免疫学检测技术的基本原理p229一.体外抗原抗体反应的特征1.高度特异性抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。2.可见性抗原与相应抗体结合后能肉眼直接观察。二.抗原抗体反应的影响因素1.温度：最适温度为37℃。2.酸碱度：最适pH=6-8。3.电解质：可促进抗原与抗体的结合。常用生理盐水。抗原抗体比例对反应现象的影响三.检测抗原和抗体的体外试验（一）凝集反应颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1．直接凝集试验（1）玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。（2）试管凝集试验：用于定量测抗体如肥达氏反应。2．间接凝集试验如类风湿因子的测定等。（二）沉淀反应可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。1．单向免疫扩散用于定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。2．双向免疫扩散主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两种抗原相关性分析。3．免疫电泳其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断。4．免疫比浊用于定量测抗原。该法快速、简便。5）免疫比浊法在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成免疫复合物。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，绘制标准曲线并根据反应液体的浊度，推算样品中的抗原含量。（三）免疫标记技术用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术免疫酶技术同位素标记技术1．免疫荧光技术(ImmunofluorescenceTechnique)用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。（1）常用荧光素异硫氰酸荧光素（FITC），显黄绿色。藻红蛋白（PE），显红色。（2）方法*直接荧光法：优点--特异性强缺点--每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。*间接荧光法优点--敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，缺点--非特异性荧光增加。2．酶免疫测定（EnzymeImmunoassay,EIA）用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。其检测的敏感度可达pg-ng/ml水平。Ab+EAbEAg+AbEAgAbE+底物呈色反应EIA（1）标记的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。（2）常用方法:A酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除.用于可溶性抗原和抗体的检测。*间接法：用于检测抗体*双抗体夹心法：用于检测抗原。B免疫组化技术—检测组织中或细胞表面的抗原。对抗原进行定性、定量、定位检测。C酶联免疫斑点试验（ELISPOT）可用于细胞因子的检测3．放射免疫测定法（RIA）敏感度可达pg水平，其标记物为125I、131I等。常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。4．化学发光免疫分析该法是将发光物吖啶酯、或鲁米诺标记抗原或抗体进行的结合反应。发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时发射出光子，用自动发光分析仪能接收光信号，测定光子的产量，以反映待检样品中抗体或抗原的含量。其灵敏度高于RIA，常用于超微量物质的测定，如甲状腺素等。5．免疫印迹法（Westernblotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。常用于检测多种病毒的抗原或抗体。如检测HIV抗体。免疫印迹法示意图HIV的免疫印记免疫胶体金技术